Sistema de terapia con antibióticos y ozono adjunto portátil para el tratamiento de Gram | Beijing AgileLift Ventures Group Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13927 (2022) Citar este artículo

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La combinación problemática de una prevalencia creciente de infecciones de la piel y los tejidos blandos y la tasa creciente de infecciones resistentes a los antibióticos que amenazan la vida presenta una necesidad urgente e insatisfecha para la industria de la salud. Estas resistencias evolutivas tienen su origen en mutaciones en las paredes celulares bacterianas que impiden la difusión eficaz de los antibióticos. Las bacterias gramnegativas son de consideración especial debido a la resistencia natural a muchos antibióticos comunes debido a la estructura bicapa única de la pared celular. El sistema desarrollado aquí brinda una solución a este problema a través de una terapia portátil que administra y utiliza ozono gaseoso como terapia complementaria con antibióticos tópicos a través de un apósito novedoso con nanofibras liberadoras de fármacos (NF). Esta tecnología aumenta drásticamente la sensibilidad de las bacterias Gram-negativas a los antibióticos comunes mediante el uso de ozono oxidativo para evitar las resistencias creadas por la pared celular bacteriana. Para permitir una aplicación sencilla y eficaz de la terapia adjunta, la administración de ozono y los antibióticos tópicos se han integrado en un solo parche de aplicación. Los NF de administración de fármacos se generan mediante electrospinning en una estera de PVA de disolución rápida sin inducir una disminución de la permeabilidad al gas del apósito. Un estudio sistemático encontró que la generación de ozono a 4 mg/h proporcionó niveles óptimos de ozono para un alto rendimiento antimicrobiano con una citotoxicidad mínima. Este tratamiento con ozono se usó con terapia complementaria suministrada por el sistema in vitro. Los resultados mostraron la erradicación completa de las bacterias gramnegativas con ozono y los antibióticos que normalmente se usan solo para las bacterias grampositivas, lo que mostró la fuerza del ozono como una opción de tratamiento auxiliar que permite sensibilizar las cepas bacterianas a antibióticos que de otro modo serían ineficaces. Además, mediante pruebas de biocompatibilidad se muestra que el tratamiento no presenta ningún efecto citotóxico en las células de fibroblastos humanos.

Dentro de la industria de la salud, las infecciones de la piel u otros tejidos blandos son una causa creciente de morbilidad en los pacientes. Estas infecciones de la piel y los tejidos blandos (SSTI, por sus siglas en inglés), que a menudo infectan las úlceras por presión (UP, por sus siglas en inglés) o las úlceras del pie diabético (DFU, por sus siglas en inglés), son parte del gran mercado mundial para el cuidado de heridas, que se estima en $ 15 mil millones de dólares en 2022 y aumentará a más de $ 22 mil millones de dólares para 20241. En los EE. UU., las IPTB son la causa del 3,5% de las visitas a la sala de emergencias y la hospitalización cuesta a los pacientes un promedio de $ 8000 dólares por estadía2,3. Se espera que estas cifras aumenten aún más en los próximos años debido a la prevalencia de enfermedades crónicas como la diabetes y el envejecimiento de la población. En los EE. UU., 34,2 millones de personas (aproximadamente el 10 % de la población) tienen diabetes4,5. A escala mundial, se estima que alrededor del 2 % de los adultos con diabetes desarrollarán una UPD cada año, lo que generará 9,1 millones de casos al año, y aproximadamente la mitad de todas las UPD se infectarán6,7,8,9. Dichas infecciones a menudo conducen a una curación reducida de la herida y otras afecciones, como osteomielitis, infección sistémica, mayor riesgo de amputación y muerte10,11,12,13.

El tratamiento típico para las infecciones por SSTI, incluidas las de las UPD, implica la administración de antibióticos. Si bien este método de tratamiento puede reducir la carga bacteriana en muchos casos, no hace nada para ayudar a promover la cicatrización temprana de heridas. Además, la resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema global creciente que reduce aún más la validez de los métodos de tratamiento actuales14,15,16. Las bacterias Gram negativas (G − ve) muestran una resistencia natural a muchos tratamientos con antibióticos debido a una membrana externa adicional en la estructura celular que evita que muchos antibióticos alcancen su objetivo previsto dentro de la célula y pueden modificarse más fácilmente para desarrollar nuevas resistencias17,18 . Esto ha llevado a un aumento tal en el número y la gravedad de las bacterias G-ve resistentes a múltiples fármacos que la Organización Mundial de la Salud (OMS) incluyó solo bacterias G-ve en su lista de cepas resistentes a los antibióticos que requieren las soluciones más urgentes18. Este problema es aún más alarmante porque el desarrollo y la aprobación de nuevos antimicrobianos efectivos en el tratamiento de patógenos G − ve resistentes a múltiples fármacos no ha seguido el ritmo de la continua aparición de nuevas resistencias en las bacterias. Esto se debe al proceso largo, costoso y de alto riesgo de desarrollo de fármacos que desincentiva la producción y la ardua tarea de aprobación regulatoria para el mercado19. Como resultado, existe una necesidad urgente de desarrollar opciones de tratamiento alternativas para las IPTB.

Esta gran necesidad ha llevado a la investigación de una serie de terapias alternativas que podrían usarse contra infecciones causadas por cepas virulentas de bacterias G-ve. Entre los más populares se encuentran el uso de plasma atmosférico frío (CAP), nanopartículas metálicas (NP) y ozono gaseoso. Investigaciones anteriores con CAP han demostrado que las partículas ionizadas generadas exhiben propiedades antimicrobianas alentadoras y también ayudan a promover factores de curación en la herida. Desafortunadamente, estos sistemas requieren equipo especializado y personal capacitado para funcionar, lo que impide la utilización de la tecnología para tratamientos frecuentes20,21. Las NP metálicas, como las hechas de cobre y plata, también se han estudiado ampliamente debido a sus fuertes propiedades antimicrobianas. Aunque los metales basados en nanopartículas han encontrado una amplia gama de aplicaciones en la terapia tópica de heridas, su principal inconveniente son los altos niveles de toxicidad para el tejido natural22,23,24. Aún más alarmantes son los informes de algunas cepas de bacterias G-ve que desarrollan resistencias a la plata25. Además, se están desarrollando parches antimicrobianos con materiales novedosos, como quitosano para parches de microagujas y esteras de nanofibras. Estos parches se utilizan como métodos de administración de factores de curación de heridas y sustancias antimicrobianas para promover la salud de las heridas26,27,28,29. Si bien dichos sistemas y plataformas han brindado nuevas rutas para una administración más profunda y efectiva de la terapia, a menudo tienen una cantidad limitada de medicamento durante lo que los hace poco prácticos para aplicaciones frecuentes con heridas crónicas30. Además, estos sistemas aún utilizan antibióticos y nanopartículas comunes, que persisten en sus aplicaciones limitadas debido a la resistencia bacteriana y la citotoxicidad, respectivamente. El ozono gaseoso, por otro lado, ha demostrado ser un tratamiento alternativo fuerte, seguro y accesible durante muchos años. Los estudios han demostrado que el ozono gaseoso aplicado tópicamente es efectivo para eliminar una amplia gama de microorganismos dañinos, incluidas bacterias, virus, hongos y más31. Esto se debe a sus fuertes tendencias oxidativas naturales que debilitan la membrana externa de la célula bacteriana a través del estrés oxidativo aplicado31. El éxito histórico del ozono como antimicrobiano ha dado lugar a una amplia gama de estudios para aplicaciones clínicas. Muchas de las pruebas in vitro se han centrado en la utilización de altas concentraciones de ozono (0,6–20 μg/mL). Los resultados indican que a tales niveles, el ozono es capaz de eliminar bacterias en tiempos de exposición muy cortos32,33. Un beneficio adicional del ozono que se ha estudiado es su capacidad para estimular la actividad de cicatrización temprana de heridas en las células, que también está relacionada con la aplicación de estrés oxidativo34,35,36,37,38,39. Aunque los tratamientos de alta concentración pueden tratar las infecciones más rápidamente, también requieren equipos e instalaciones especiales y pueden dañar el tejido sano por sobreexposición. Sin embargo, los avances de los sistemas electrónicos y los fotosistemas de energía han proporcionado la capacidad de generar una concentración relativamente más baja de ozono a través de sistemas de descarga de corona miniaturizados. Dichos sistemas pueden brindar la posibilidad única de proporcionar niveles bajos y más sostenidos de ozono en el sitio de la herida objetivo con un enfoque de generación portátil, que elimina la necesidad de equipos especializados y personal capacitado y reduce en gran medida el riesgo de dañar las células sanas32,40.

Además de utilizar la ozonoterapia como tratamiento independiente, se propone que la combinación del ozono como terapia adjunta con los antibióticos actuales mejoraría significativamente el rendimiento de ambas terapias, especialmente contra las cepas resistentes de la bacteria G-ve. El uso de una terapia complementaria para aumentar la eficacia de los antibióticos se ha estudiado previamente con electroporación, fotosíntesis química de especies reactivas de oxígeno (ROS) e inyección intraperitoneal de ozono41,42,43. La mayor eficacia de los antibióticos en tales sistemas de terapia combinada ha sido explicada por el proceso de mayor difusión de antibióticos en las células bacterianas a través del tratamiento secundario que daña la membrana externa de las células bacterianas. Si bien estos métodos han mostrado resultados iniciales positivos, existen limitaciones significativas de cada uno, incluida la profundidad de penetración limitada debido a la citotoxicidad de la electroporación, la síntesis química necesaria para la fotogeneración de ROS y el procedimiento invasivo para la inyección de ozono. El ozono tópico aplicado a través de un parche portátil puede proporcionar las mismas propiedades sinérgicas al oxidar la membrana celular y crear agujeros para que el antibiótico pase a través de la célula44. Esta técnica es eficaz para generar un efecto sinérgico entre las terapias complementarias y antibióticas. Un beneficio adicional de tales tratamientos es que las membranas bacterianas comprometidas aumentarán la cantidad de opciones de tratamiento con antibióticos disponibles. Debido a la reducción de las defensas de la membrana externa, que son la principal diferenciación entre las cepas Gram-positivas (G + ve) y G-ve, se espera que la ozonoterapia adyuvante permita que los antibióticos que comúnmente son efectivos en G + ve funcionan eficazmente en G - cinco cepas de bacterias. El uso de ozono para eludir las resistencias intrínsecas o desarrolladas a los antibióticos de las bacterias G − ve permitirá el uso prolongado de las tecnologías antibióticas actuales. Las dos terapias combinadas también permitirán una dosis reducida de antibióticos y ozono, lo que limitará los efectos negativos para la salud de la exposición a altas concentraciones de ozono y reducirá la tasa de desarrollo de nuevas resistencias a los antibióticos.

Aquí, describimos el desarrollo de un novedoso sistema terapéutico integrado para la administración tópica de ozono adjunto y tratamiento antibiótico para heridas dérmicas infectadas, especialmente aquellas causadas por bacterias G - ve resistentes a los medicamentos que requieren nuevos antimicrobianos. Este sistema se compone de dos partes, una unidad portátil de generación de ozono y un parche de aplicación desechable para interactuar con la superficie de la herida. El sistema de generación de ozono contiene un generador de ozono de baja potencia y un microsoplador que están controlados por un paquete de baterías y un microcontrolador incorporados, lo que permite la entrega controlada de ozono de 0 a 4 mg/h. El parche para heridas cuenta con una estructura de tres capas que contiene una capa de difusión interna para permitir una aplicación de ozono más uniforme al provocar la distribución física del flujo a través de los poros, una membrana hidrófoba y permeable a los gases para evitar la absorción de fluidos en el apósito y una membrana biodegradable. Malla liberadora de fármacos de nanofibras (NF) para la aplicación tópica de antibióticos45. Esto creará un sistema completamente integrado para permitir la terapia complementaria tópica de antibióticos con ozono gaseoso. El parche se aplica directamente en el sitio de la herida. Allí, las fibras de polímero biodisolubles se rompen al entrar en contacto con el lecho de la herida y liberan la carga útil de antibiótico por vía tópica a la herida. Al mismo tiempo, se bombea ozono gaseoso desde un sistema de generación de ozono externo portátil a través del parche adjunto y sobre la superficie de la herida, como se muestra en la Fig. 1, proporcionando una acción antimicrobiana adicional y aumentando el efecto antibiótico a través de una mayor difusión debido a la porción oxidativa de la bacteria. membranas

Sistema de terapia antibiótica tópica y ozono adjunto portátil. (a) La terapia complementaria con ozono y antibióticos se puede utilizar como un tratamiento alternativo para las infecciones de la piel y los tejidos blandos que no responden a las terapias tradicionales. El ozono proporciona propiedades antimicrobianas y permite que los antibióticos ingresen a las células e interrumpan las funciones celulares, como la producción de proteínas. (b) El sistema utiliza ozono gaseoso y una malla de nanofibras permeable a los gases y liberadora de fármacos para tratar heridas en desarrollo en el siguiente proceso: (i) Se aplica a la piel un parche para heridas todo en uno con una malla de nanofibras liberadoras de fármacos y una membrana permeable a los gases. herida. (ii) los NF comienzan a disolverse y liberan los antibióticos tópicos. (iii) Se aplica ozono al sistema durante todo el tratamiento, ya que los antibióticos tópicos se liberan por completo de los NF. El ozono y los antibióticos trabajan juntos para eliminar la infección. (iv) Una vez que la herida ha cicatrizado, se retira el parche de la herida del área. La combinación de tratamiento con ozono y antibióticos puede tratar las infecciones resistentes a los antibióticos y prevenir el desarrollo de nuevas infecciones, lo que conduce a tiempos de curación más rápidos.

Para que el sistema sea efectivo, se consideraron los siguientes criterios de ingeniería. En primer lugar, la portabilidad del sistema es importante para garantizar que los pacientes puedan acceder al tratamiento durante largos períodos de tiempo sin estar confinados por equipos clínicos o ataduras inamovibles, de modo que los pacientes puedan autoadministrarse fácilmente su medicación en casa, discretamente y sin interferir con su estilo de vida La fuente de energía portátil es capaz de alimentar un solo generador, que produce de 0 a 4 mg/h, o dos generadores que producen de 0 a 8 mg/h de ozono. Para identificar la tasa óptima de generación de ozono, se llevó a cabo una investigación sistemática de las propiedades antimicrobianas y biocompatibles del ozono a diferentes tasas de generación. En segundo lugar, el sistema de ozono optimizado se probó en combinación con antibióticos tópicos para estudiar la mejora sinérgica del tratamiento de bacterias G-ve en condiciones fisiológicamente relevantes. Estos tratamientos se centraron en la utilización de ozono para sensibilizar a las bacterias G-ve a los antibióticos comúnmente utilizados en los patógenos G+ve. Debido a que la aplicación del ozono gaseoso y el antibiótico deben poder existir simultáneamente, la administración tópica típica de antibióticos, como una crema, crea una barrera a la difusión del ozono. Como tal, el sistema informado utiliza una estera de nanofibras (NF) biosolubles para administrar los antibióticos por vía tópica. En este estudio, seleccionamos dos antibióticos comunes para el tratamiento de infecciones G + ve, vancomicina y linezolid, para usarlos como prueba de concepto. En el estudio se demostró que la combinación de ozono y estos antibióticos provoca un aumento significativo de la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, hay motivos para creer que el ozono es un tratamiento complementario clave para dar nueva vida a los antibióticos a los que antes se había resistido. Además, el sistema fue diseñado para la traducción del producto a través de ensayos clínicos al mercado mediante el uso de materiales de bajo costo (costo del parche desechable: < $2.50) y un método de tratamiento tópico que sería fácil de implementar en el entorno clínico37.

Se diseñó un sistema de generación y suministro de ozono para permitir la terapia tópica de heridas con ozono y antibióticos (Fig. 2a). El sistema cuenta con un sistema de generación de ozono integrado que utiliza una descarga de corona para producir ozono gaseoso a partir del aire ambiente y un sistema de microventiladores para distribuir el ozono generado. Una batería integrada alimentó el sistema con interruptores para el control del usuario de la función de ozono y soplador. El diseño permite la generación y aplicación de ozono en el punto de atención desde un sistema portátil y reutilizable para una fácil incorporación a las prácticas clínicas actuales. Los niveles de generación de ozono del sistema se caracterizaron para cuantificar la producción de ozono en cada entorno de generación. La salida del generador de ozono se controló a través de una señal de modulación de ancho de pulso (PWM) del microcontrolador y la concentración de ozono en la salida de flujo se midió usando un sensor de ozono comercial. La Figura 2b muestra los resultados de la concentración de ozono medida por triplicado en tres configuraciones diferentes de generación de masa en el sistema portátil de suministro de ozono desarrollado. Los niveles de ozono se midieron a 100 partes por millón (ppm) para tasas de generación de 2 mg/h, 132 ppm para 4 mg/h y 204 ppm para 8 mg/h. Esto muestra que la concentración de ozono en ppm es aproximadamente lineal en respuesta a la tasa de generación de masa del sistema cuando se considera una compensación de generación de línea base de ozono. Este comportamiento controlable permite la investigación de tasas de generación optimizadas para el tratamiento de ozono de aplicación.

Sistema de terapia antibiótica tópica y ozono adjunto portátil. (a) Sistema de tratamiento de heridas con ozono diseñado para administrar tratamiento complementario con ozono y antibióticos por vía tópica a las heridas dérmicas. Sistema compuesto por un sistema portátil de generación de ozono con microsoplador para la entrega de ozono y una malla porosa de nanofibras de PVA liberadoras de fármacos para la entrega de antibióticos. El sistema recargable portátil está instalado en una carcasa personalizada y utiliza componentes electrónicos de bajo consumo integrados para. (b) Relación de la concentración de ozono creada por el sistema portátil con la tasa de generación de masa. Las barras de error indican la desviación estándar.

El parche de terapia adjunto diseñado para este sistema consta de tres capas, una capa de dispersión interna para aumentar el área de cobertura del ozono, un apósito hidrofóbico para interactuar con la herida y una malla NF liberadora de fármacos biodegradable. La capa de dispersión interna se creó a partir de una malla de polímero poroso con tamaños de poro de 0,003 a 0,02 mm2 (medidos con ImageJ a partir de imágenes de microscopio) para permitir que el gas de ozono se difunda antes de cruzar el apósito permeable al lecho de la herida. Anteriormente se demostró que esto aumenta significativamente el área y la uniformidad de la cobertura de ozono en el sitio de la herida37. La membrana permeable a los gases se trató con polidimetilsiloxano (PDMS) para inducir la hidrofobicidad. Este tratamiento evita la absorción de líquido en los poros del apósito, lo que afectaría negativamente la difusión del ozono en el lecho de la herida para el tratamiento37. Debido a que los métodos tradicionales de aplicación tópica de antibióticos, como las cremas, inhiben la difusión del ozono, se utilizó la malla biodegradable NF. Esta malla se creó a partir de alcohol polivinílico (PVA) y una solución antibiótica mediante un proceso de electrohilado. Esto permitió la creación de hebras de polímero de tamaño nanométrico en una estructura de malla superpuesta permeable al gas directamente sobre el parche de aplicación.

Con el fin de identificar la estructura y las propiedades de los NF, se realizaron imágenes de microscopio y microscopio electrónico de barrido (SEM) en los NF que se generaron a través del proceso de electrohilado. La Figura 3a-h muestra los resultados de las imágenes tanto de un microscopio óptico (OM) como del SEM. La comparación de imágenes del apósito tratado con PDMS antes y después de la aplicación y disolución de NF muestra que no hay cambios en la estructura causados por la deposición y disolución de los NF eluidos del fármaco. Esta propiedad se confirmó y cuantificó adicionalmente en las caracterizaciones siguientes. Viendo las imágenes de los NF depositados en el apósito, se puede concluir que la malla generada vuelve a tener una estructura porosa. Se midió que el tamaño de la fibra era de 300 nm de diámetro para las fibras que contenían vancomicina y de 100 nm de diámetro para las fibras que contenían linezolid. Se espera que esta diferencia de tamaño se deba al mayor tamaño molecular de la vancomicina (1449,3 Da frente a 337,3 Da de linezolid)46,47.

Propiedades de la estera electrohilada NF. Imagen de microscopio de (a, e) superficie del parche de suministro de ozono y (b, f) después de recubrir con linezolid que contiene NF, (c, g) y después de recubrir con vancomicina que contiene NF, (d, h) después de la disolución de los NF. Las imágenes se tomaron con microscopio óptico (a–d) y SEM (e–h). (i) Histograma que muestra la frecuencia del tamaño de los poros dentro de las esteras de fibra hilada de vancomicina y linezolida. (j) Medición del ángulo de contacto del vendaje en varias etapas del tratamiento. Las barras de error indican la desviación estándar.

Se realizó un análisis adicional con el software ImageJ (Fig. 3i). Se midió el tamaño de los poros dentro de la malla electrohilada creada con ambos antibióticos. Los datos se recopilaron en un histograma. Los resultados indican que hay poca variación entre los tamaños de los poros en cada malla, ya que ambas tienen una mayoría de poros (50,8 % para vancomicina y 53,5 % para linezolid) por debajo de 0,025 μm2, aunque la malla de linezolid tenía una mayor proporción de poros mayor que 0,35 µm2 (4,1 % frente a 1,4 %). Esto indica que la porosidad debida al conglomerado de fibras debería ser similar entre las dos mallas, con cualquier variación proveniente del aumento de la masa de fibras de linezolid depositadas.

La hidrofobicidad/hidrofilicidad del apósito poroso también fue importante para la aplicación tópica de ozono. Los altos niveles de hidrofilia de la capa NF acelerarán la interacción de fluidos y conducirán a una rápida disolución y aplicación de antibióticos. Por otro lado, son necesarios altos niveles de hidrofobicidad para el vendaje para heridas que se encuentra debajo para repeler la absorción de fluidos en los poros del vendaje que inhibirían el movimiento del ozono desde el parche hacia el sitio de la herida. Debido a esto, se investigó la naturaleza hidrófoba del apósito. El ángulo de contacto se midió en muestras de preparación antes de la deposición de NF, en muestras de preparación con revestimiento de NF y en muestras de preparación después de que los NF se disolvieran por completo de la superficie. El ángulo de contacto de la muestra corresponde a la hidrofobicidad. Como se describió en nuestro trabajo anterior, las propiedades hidrofóbicas se inculcaron en el apósito a través de un recubrimiento de PDMS diluido en las fibras37. Se observó que el ángulo de contacto del apósito tratado con PDMS era de 135° antes del depósito de NF y de 140+° después de que el NF se hubiera disuelto completamente de la superficie. También se puede observar que tanto los NF con linezolid como con vancomicina tienen ángulos de contacto mucho más bajos, 0° y 82°, respectivamente. Estos resultados indican que el comportamiento hidrofóbico del apósito diseñado no cambia después de que los NF se hayan disuelto de la superficie del parche (Fig. 3j). Por lo tanto, la hidrofobicidad deseada del parche se mantiene a lo largo del tiempo de tratamiento, mientras que la naturaleza hidrofílica que muestra la capa NF permite una disolución rápida a través de un mayor contacto con el fluido.

Otra propiedad importante para el rendimiento general del tratamiento es la porosidad del apósito con y sin la capa de NF, ya que la porosidad del apósito permite que el ozono gaseoso penetre y afecte tópicamente el área de la herida. El efecto de la porosidad de la malla se cuantificó midiendo la presión del flujo interno a medida que se bombeaba un caudal constante a través del vendaje. Se varió el estado del apósito para caracterizarlo en diferentes momentos del proceso de tratamiento.

La figura 4a muestra la presión interna medida a medida que se empujaba el aire a velocidades de flujo que oscilaban entre 5 y 25 ml/min. Las muestras analizadas incluyen un flujo de referencia a través del sistema sin parche (abierto), una muestra prístina del apósito hidrofóbico (sin tratar) y muestras de apósito hidrofóbico con NF y después de la disolución del NF. Puede verse que no hay un aumento perceptible en la resistencia al flujo para ninguna de las muestras excepto para el vendaje con fibras de linezolida depositadas. La resistencia al flujo aumentó en aproximadamente un 80 % con el caudal más alto (Fig. 4b). Este aumento se debió a la adición de una capa significativa de NF liberadores de fármacos. Los NF se depositaron de manera que la capa sobre el parche contenía antibióticos a la concentración inhibitoria de 20 μg/cm2. Las diferentes solubilidades de vancomicina y linezolida dieron lugar a una capa más gruesa de fibras de linezolida que de vancomicina, ya que se cargó más vancomicina en cada fibra por unidad de masa (0,1 % p/p de vancomicina frente a 0,03 % p/p de linezolida). Debido a que se depositan muchas más fibras de linezolida que de vancomicina (667 μg/cm2 frente a 100 μg/cm2 para la vancomicina), hubo un efecto mucho mayor sobre la resistencia al flujo gaseoso a pesar de la relativa similitud en el tamaño de los poros discutida en la sección anterior. Aún así, incluso los mayores niveles de porosidad no impidieron el flujo gaseoso, ya que el efecto general se redujo debido a la estructura de malla porosa de los NF que se ve en la Fig. 3. Además, la naturaleza de disolución rápida de las fibras (como se analiza a continuación) significa que se espera que esta disminución temporal de la porosidad sea insignificante.

Caracterización de la porosidad del apósito de ozono con y sin revestimiento de NF que eluye el fármaco. (a) Resistencia al flujo interno a caudales variables para aderezos en diferentes etapas de aplicación. (b) Comparación de la resistencia al flujo interno a 25 ml/min. Las barras de error indican la desviación estándar.

Existe una extensa investigación que valida el uso de NF en la administración de fármacos con una amplia gama de tiempos de liberación diseñados desde minutos hasta días48,49,50,51,52,53,54,55,56. La caracterización del tiempo de disolución de los NF permite conocer la velocidad a la que se aplica el antibiótico activo en el área de la herida para el tratamiento y la duración durante la cual se reduce la porosidad del apósito en el caso de linezolid NF. Es beneficioso que el antibiótico se libere rápidamente en este caso para permitir la interacción con las células bacterianas a medida que aumenta la absorción molecular debido a los poros en las membranas de las células bacterianas causados por el ozono57,58. Para caracterizar el tiempo de disolución, los NF que contenían un colorante con un peso molecular similar al de cada antibiótico se sometieron a electrocentrifugado en las mismas condiciones que los modelos para la disolución de los NF que eluyen el fármaco. Cada muestra de NF se cortó a medida y se expuso a agua desionizada durante un tiempo designado. Se tomaron medidas de absorbancia óptica de las muestras de fluido y se compararon con una lectura de muestra totalmente disuelta. A continuación, estos datos se organizaron para mostrar el porcentaje de disolución a lo largo del tiempo.

Antes de caracterizar completamente la velocidad de disolución, se realizó un estudio para comprender cómo la hidrolización del PVA utilizado para generar las fibras afecta la solubilidad. La hidrolización es una propiedad del PVA que indica el grado en que se eliminan los grupos acetato durante el proceso de síntesis a partir del acetato de polivinilo59,60. El efecto de la hidrolización se probó como se ve en la Fig. 5a. Con el tiempo, los NF completamente hidrolizados no se disolvieron, mientras que las fibras parcialmente hidrolizadas se disolvieron rápidamente. Esto se debe a las fuertes interacciones de los enlaces de hidrógeno que evitan que las fibras totalmente hidrolizadas se disuelvan por debajo de los 80 °C. Por lo tanto, el PVA parcialmente hidrolizado se eligió como óptimo para fibras de disolución rápida. A continuación, se caracterizó por completo la disolución de los NF para los NF modelo de linezolida y vancomicina. Como se indica en la Fig. 5b, ambas fibras mostraron una alta velocidad de disolución. Se observó que las fibras modelo de linezolida comenzaban a disolverse más rápido, probablemente debido al tamaño más pequeño, pero las fibras modelo de vancomicina alcanzaron la disolución completa primero (7 minutos) debido a la menor masa de fibras que era necesario disolver. Aún así, las fibras de linezolid alcanzaron la disolución completa después de 9 min. Según esta observación, será necesario aplicar el parche sobre la herida durante unos minutos antes de activar el suministro de ozono para garantizar la disolución completa de las fibras y la difusión en el sitio de la herida antes de aplicar el ozono.

Caracterización de la disolución de NFs eluyentes de fármacos. ( a ) Tasa de disolución de NF fabricado con PVA parcialmente hidrolizado y totalmente hidrolizado. (b) Disolución a lo largo del tiempo de NF parcialmente hidrolizados infundidos con troqueles que imitan fármacos (rojo para vancomicina y azul para linezolid). (c) Proporción de material disuelto por tiempo crítico de 10 min (< 3% de duración total del tratamiento) para NF en medios líquidos y gel. ( d ) Comparación del tiempo necesario para lograr la disolución crítica de los NF de colorante azul (linezolid) en solución tampón con diferentes niveles de pH. Las barras de error indican la desviación estándar.

Es importante que los NF utilizados para la aplicación de los antibióticos puedan disolverse en un período corto en comparación con la duración total del tratamiento para maximizar la duración en la que ambos componentes de la terapia complementaria están activos dentro del lecho de la herida. Se determinó que un tiempo total de disolución de hasta 10 min debería ser más que suficiente para permitir la actividad adecuada tanto del ozono como de los antibióticos utilizados en el tratamiento. Los NF se probaron para cumplir con este criterio en agua DI (como se describió anteriormente) y en gel de agar para imitar un entorno de herida semisólido simulado. La Figura 5c muestra los resultados, lo que indica que incluso en el entorno de gel para heridas simulado, los NF se disolvieron por completo en el plazo deseado de 10 minutos. Por último, debido a que el pH que se encuentra en el lecho de una herida infectada puede variar, la disolución de las fibras modelo de linezolida en soluciones se caracterizó con tres valores de pH diferentes. Las fibras se cortaron nuevamente a medida y se expusieron a soluciones tampón con valores de pH de 6, 7 y 8. La Figura 5d muestra una comparación del tiempo necesario para alcanzar la disolución crítica (> 80 %) en cada pH. Puede verse a partir de los resultados que el pH de la solución tuvo muy poco efecto sobre el tiempo de disolución.

Antes de evaluar la terapia de combinación, se llevó a cabo un estudio sistemático de los niveles de tratamiento con ozono para identificar la concentración adecuada de la terapia de ozono para maximizar las propiedades bactericidas y tener un efecto tóxico mínimo en las células humanas. Para esta prueba, se probaron tres tasas diferentes de generación de ozono, 2 mg/h, 4 mg/h y 8 mg/h, como tratamiento de P. aeruginosa y E. coli, dos de las bacterias G-ve más comunes en heridas. infecciones61. Los cultivos de bacterias se suspendieron en PBS para una mejor observación de las propiedades antimicrobianas de cada tasa de generación. Se eligió PBS como medio de cultivo de prueba para estos experimentos para proporcionar un entorno homeostático en el que las bacterias no muriesen ni se reprodujesen activamente. Esto permitió una comparación explícita de las propiedades antimicrobianas del tratamiento con ozono en diferentes niveles de aplicación. La Figura 6 muestra que en ambas cepas, las tasas más altas de generación de ozono produjeron una destrucción más rápida, como se esperaba, mientras que P. aeruginosa mostró una mayor sensibilidad al tratamiento con ozono en general. Los cultivos de P. aeruginosa se eliminaron de los pocillos de prueba después de 5, 3 y 2 h respectivamente para tasas de generación de ozono de 2 mg/h, 4 mg/h y 8 mg/h, mostrando un aumento más significativo en la eficacia al aumentar la generación de 2 mg/h. a 4 mg/h que cuando se aumenta más de 4 a 8 mg/h. Los resultados sobre E. coli también respaldan esta tendencia. No se observó la eliminación total de cultivos de E. coli en 8 h a una tasa de generación de ozono de 2 mg/h, mientras que 4 mg/h mostraron eliminación después de 5 h y 8 mg/h después de 3 h.

Eficacia antimicrobiana y viabilidad celular bajo exposición continua a diferentes niveles de ozono (2-8 mg/h). Efecto antimicrobiano contra (a) cultivos de bacterias P. aeruginosa y (b) E. coli en PBS en el transcurso de 8 h. ( c ) Viabilidad celular de fibroblastos humanos tratados con 6 h de ozono a 2–8 mg/h a 37 °C. La viabilidad se midió 1 día, 3 días y 7 días después de finalizar el tratamiento. ( d ) Tinción viva / muerta de células de fibroblastos humanos expuestas a niveles variables de terapia de ozono 1 día y 7 días después del tratamiento. Las barras de error indican la desviación estándar.

También se investigó el efecto de la variación de las tasas de generación de ozono de los fibroblastos humanos. La figura 6c muestra el porcentaje de células sanas después de 6 h de exposición al ozono en cada tasa de generación 1 día, 3 días y 7 días después de la exposición, que se puede ver en la figura 6d. Se puede observar que niveles más altos de ozono, a saber, 8 mg/h, inducen estrés en las células, lo que lleva a una reducción del 50 % en la viabilidad, mientras que tanto 2 mg/h como 4 mg/h no mostraron signos de toxicidad. Teniendo en cuenta tanto el rendimiento antimicrobiano como la citotoxicidad de cada condición, 4 mg/h mostraron la capacidad de proporcionar propiedades antimicrobianas rápidas y eficaces con una citotoxicidad mínima y, por lo tanto, se eligió como la configuración adecuada para la generación de ozono.

Debido a que el entorno de la herida es propicio para el crecimiento bacteriano, la tasa acelerada de replicación requerirá una mayor concentración de ozono para obtener suficientes propiedades antimicrobianas. Si bien es efectivo, esto puede resultar en efectos secundarios citotóxicos para las células humanas. Para contrarrestar esta preocupación, se presenta un estudio sistemático del efecto combinado de los antibióticos con la terapia de ozono adjunta para proporcionar una mayor acción antimicrobiana sin efectos secundarios dañinos. Para mostrar el impacto positivo del uso de la terapia adjunta, el tratamiento con ozono y antibióticos se probó en cepas de P. aeruginosa y E. coli, bacterias G-ve que se encuentran comúnmente en las SSTI. Para estas pruebas, se seleccionaron dos antibióticos de uso común para tratar bacterias G+ve, vancomicina y linezolid. Al seleccionar los antibióticos que normalmente se usan solo en las bacterias G + ve, estas pruebas pudieron demostrar una prueba de concepto para el ozono como terapia adjunta para sensibilizar a las bacterias G - ve a los antibióticos resistentes. Además, el tratamiento se realizó en cultivos de bacterias en medio de cultivo de caldo de soya tríptico y 37 °C. Estas condiciones, óptimas para el crecimiento de bacterias, se eligieron para mostrar la fuerza del tratamiento complementario en un entorno que iguala o supera las de una herida natural para promover el crecimiento de bacterias. Además, el crecimiento de bacterias, que está presente tanto en una herida infectada como en las condiciones simuladas que se presentan aquí, es necesario para ver el efecto completo que los antibióticos tienen sobre las bacterias.

La Figura 7 muestra los resultados de las propiedades antibacterianas y los resultados de biocompatibilidad de la terapia complementaria. La Figura 7a indica que la terapia adjunta de linezolid y ozono gaseoso mostró un aumento significativo en la actividad antibacteriana. En comparación con la medición inicial de CFU/mL de bacterias, tanto el control negativo (sin tratamiento) como los controles de linezolida y vancomicina (solo antibióticos) mostraron un crecimiento significativo en la población a medida que las bacterias sanas en los medios continuaban proliferando. Esto muestra que los antibióticos por sí solos no inhibieron el crecimiento de las bacterias como se esperaba. La muestra de ozono, que se expuso a 4 mg/h de ozono durante 6 h, mostró una modesta reducción bacteriana de 1,52 log10 CFU/mL. Cuando se combinó con vancomicina, el tratamiento adjunto mostró una reducción significativa de 2,52 log10 CFU/mL. Además, el ozono combinado con linezolid mostró una eficacia aún mayor con la eliminación completa de todas las bacterias (6,62 log10 CFU/mL). El análisis estadístico indicó resultados estadísticamente significativos tanto para el ozono como para las terapias combinadas (p < 0,0001). En ambos casos, los resultados indican que los tratamientos con ozono y antibióticos juntos son más efectivos que la suma de las partes.

Eficacia antibacteriana contra cultivos de bacterias en medios TSB y resultados de viabilidad celular de la prueba de ozono y terapia antibiótica adjunta in vitro a 37 °C. (a) Resultados de la terapia adjunta de ozono + linezolid y ozono + vancomicina en P. aeruginosa. (b) Resultados antibacterianos de la terapia adjunta de ozono + linezolida y ozono + vancomicina en E. coli. Se aplicó ozono a 4 mg/h durante 6 h. Se aplicó linezolid y vancomicina en solución a 200 μg/mL. ( c ) La viabilidad de las células de fibroblastos humanos expuestas a 6 h de tratamiento con ozono, ozono + vancomicina y ozono + linezolid se midió 1 día, 3 días y 7 días después de que finalizó el tratamiento. ( d ) Tinción viva / muerta de fibroblastos humanos 1 día y 7 días después de que finalizó el tratamiento. Las barras de error indican la desviación estándar.

El mismo procedimiento de prueba también se realizó en E. coli, otra bacteria G-ve que se encuentra comúnmente en las heridas dérmicas. La Figura 7b muestra los resultados de las terapias complementarias con vancomicina y linezolida. Como se vio con P. aeruginosa, el control negativo y los controles con antibióticos no mostraron inhibición del crecimiento bacteriano durante el tratamiento de 6 horas. La terapia de ozono sola no mostró una disminución en la población de bacterias, mientras que la terapia de combinación nuevamente mostró un aumento significativo en la eficacia, con la terapia adjunta de linezolid eliminando completamente las bacterias (reducción de 6.02 log10 CFU/mL) y la terapia adjunta de vancomicina permitiendo una reducción de 0.57 log10 CFU/ reducción de ml. La diferencia en el rendimiento de linezolid y vancomicina puede explicarse por las dos moléculas y mecanismos de acción diferentes. Se sabe que la vancomicina funciona uniéndose a la capa peptídica de la pared celular, lo que inhibe el entrecruzamiento y conduce a la lisis celular durante la división. Debido a que la vancomicina es una molécula grande (1449,3 Da), generalmente se le prohíbe acceder a la capa peptídica en las bacterias G-ve debido a la capa lipídica externa adicional presente en dichas cepas62,63. Se supone que el ozono permite que algunas moléculas de vancomicina eviten esta capa protectora a través de la interrupción oxidativa, pero la eficiencia no es suficiente para una acción de fuerza completa. Linezolid, por otro lado, es una molécula mucho más pequeña (337,3 Da) que inhibe la reproducción de las bacterias al unirse a las cadenas de ARN necesarias para la producción de proteínas64,65. Debido a su tamaño más pequeño, linezolid puede acceder más fácilmente a la célula bacteriana a través de los agujeros oxidativos que crea el ozono. Además, la combinación de dos mecanismos de acción diferentes aplicados por el ozono y el linezolid es capaz de mostrar una mayor eficacia en la eliminación de bacterias en las mismas condiciones de aplicación. Estos resultados confirman los beneficios del uso de ozono gaseoso como terapia complementaria para sensibilizar a las bacterias G − ve a los antibióticos que normalmente se usan solo para las cepas G + ve. Esto es crucial porque es una prueba de concepto, que muestra que las reacciones oxidativas causadas por el ozono permiten que nuevas moléculas antibióticas funcionen contra bacterias que anteriormente eran esencialmente inmunes a sus efectos. Al aumentar la cantidad de antibióticos efectivos y eludir potencialmente las resistencias desarrolladas, este enfoque combinado puede proporcionar medios para reutilizar antibióticos que ya no eran efectivos.

Finalmente, para asegurar que la aplicación de ozono no tenga un efecto negativo en la función de los antibióticos, se realizaron dos pruebas. En primer lugar, se tomaron lecturas de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de ambas muestras de antibióticos antes y después de 8 h de exposición al ozono y no mostraron cambios en la estructura molecular. En segundo lugar, las pruebas antibacterianas que utilizan vancomicina y linezolid en bacterias G + ve antes y después de 8 h de exposición al ozono tampoco muestran cambios en la eficacia debido a la exposición prolongada al ozono a 4 mg/h. Estas dos pruebas validan aún más que el ozono gaseoso administrado a través del parche no causó efectos adversos a los compuestos antibióticos. Consulte la información de apoyo para obtener más detalles.

Anteriormente se demostró que la exposición a largo plazo (6 h) de células de fibroblastos humanos al ozono gaseoso producido a 4 mg/h no mostró signos de estrés ni viabilidad reducida en las células. Aquí, también fue importante evaluar la seguridad de la terapia combinada de antibióticos tópicos como ozono gaseoso a estos niveles y validar que la terapia combinada no crea compuestos citotóxicos. Al estudiar la biocompatibilidad, pudimos demostrar que el sistema de tratamiento es efectivo y seguro de usar. Para validar esto, se realizaron pruebas de biocompatibilidad sistémica en células de fibroblastos humanos, en las que las células se expusieron a la terapia de ozono (con o sin antibióticos) o se dejaron como control. En cada caso, las muestras de células se expusieron a la concentración inhibidora de prueba de una solución que contenía linezolida, vancomicina o ningún antibiótico. Las pruebas se realizaron bajo los mismos parámetros de ozono de 6 h y 4 mg/h que los estudios antibacterianos. La Figura 7c muestra los resultados de un ensayo MTT in vitro y una tinción viva/muerta (Fig. 7d) que se realizaron para evaluar la viabilidad de las células de fibroblastos (normalizadas frente al grupo de control) tratadas con antibióticos en combinación con nanofibras electrohiladas que eluyen antibióticos. . El porcentaje de viabilidad de las células tratadas con ozono, ozono + vancomicina, ozono + linezolid fue del 98,6 %, 99 % y 98,2 % respectivamente después de 1 día y del 98,8 %, 98,5 % y 97,2 % respectivamente después de 7 días. Estos resultados muestran que el enfoque de tratamiento combinado no tuvo ningún efecto adverso sobre la viabilidad de las células de fibroblastos.

En este trabajo, presentamos por primera vez un dispositivo portátil para la aplicación integrada de ozono complementario y terapia antibiótica dirigida a cepas resistentes de bacterias G-ve. El novedoso sistema de suministro combinado de ozono gaseoso y antibiótico se logra mediante el uso de nanofibras de PVA de disolución rápida que contienen antibióticos. Se consideró que el desarrollo, la estructura y la permeabilidad de la estera NF eran muy propicios para el tratamiento adjunto. Se realizó la optimización de los niveles de ozono aplicados por el sistema para lograr un tratamiento con alta eficacia antibacteriana con mínima citotoxicidad para las células humanas. Finalmente, se llevó a cabo un extenso trabajo para validar la eficacia de la terapia adjunta entre el ozono y dos antibióticos comúnmente efectivos contra las bacterias G+ve, vancomicina y linezolid. Se demostró que esta combinación aumenta significativamente el tratamiento de las bacterias gramnegativas Pseudomonas aeruginosa y E. coli in vitro, sin mostrar signos de citotoxicidad. Este sistema tiene una gran promesa de ser un método de terapia eficaz para heridas dérmicas infectadas y puede aumentar significativamente la cantidad de opciones de tratamiento disponibles para médicos y pacientes a medida que la prevalencia de infecciones resistentes a los antibióticos continúa aumentando. La investigación in vivo sistemática adicional en esta área proporcionará la validación necesaria a medida que la tecnología se desarrolle hacia los ensayos clínicos y el uso en humanos. Esta plataforma podría brindar una nueva oportunidad para usar la terapia de combinación de ozono para hacer que los antibióticos anteriores vuelvan a ser más efectivos. Es un paso crucial para ayudar a resolver la crisis de las heridas crónicas y el tratamiento de las infecciones resistentes.

El apósito para heridas y el parche se fabricaron utilizando el mismo proceso descrito en nuestro trabajo anterior37. En resumen, una mezcla de PDMS (Sylgard 184) se diluyó 1:5 p/p en heptano y se usó para recubrir el tejido de rayón-spandex (84,5 mm × 67 mm) que se usa para crear el vendaje para inducir propiedades hidrofóbicas. Después del secado, esto se une al respaldo de PDMS con la capa de dispersión interna utilizada para aumentar el área afectada por el ozono en el medio. El sistema se adhirió utilizando tiras adhesivas de doble cara 3M 300LSE. Los NF de liberación de fármacos biodegradables se hilaron a partir de una solución de alcohol polivinílico (PVA) (seleccionada debido a su biocompatibilidad bien documentada y alta solubilidad en agua) y agua (10 % p/p de PVA). Los antibióticos se agregaron al 1 % p/p tanto para el clorhidrato de vancomicina (1404-93-9 Chemimpex) como para el linezolid (165800-03-3 Chemimpex). Para generar la malla NF, el vendaje se adhirió al tambor de la máquina de electrohilado (Tong Li Tech TL-Pro-BM). Las fibras se hilaron con una aguja utilizando una punta de 18 g con 20 kV y un potencial de -2 kV y un caudal de 0,65 ml/min a una distancia de la punta al colector de 14 cm utilizando una solución de PVA al 10 % p/p en agua (P1763 totalmente PVA hidrolizado o 843.869 PVA parcialmente hidrolizado (MW = 70.000), Sigma-Aldrich). Las fibras se depositaron sobre un sustrato fijado a un tambor giratorio (10 cm de diámetro, 30 RPM) para alcanzar una concentración de antibiótico de 200 µg/cm2.

Se realizaron imágenes de las fibras para identificar la estructura, el tamaño y el poro de la malla generada. La imagen óptica se realizó utilizando un Steindorff OM. Las imágenes SEM se capturaron con un SEM de emisión de campo Hitachi S-4800 a 4 kV y 20 mA después de que las muestras se cubrieron por pulverización con Au-Pd a 36 nm. El procesamiento de imágenes permitió la medición del tamaño de fibra y poro en las imágenes capturadas y se realizó con el software ImageJ con las herramientas de medición y análisis de partículas.

Las mediciones del ángulo de contacto utilizadas para cuantificar la hidrofobicidad de la muestra se tomaron por triplicado con un goniómetro avanzado Ramé-Hart Modelo 290 F1. Las mediciones de presión del flujo de aire se capturaron por triplicado con un sensor de presión Omega DPG 4000 y el flujo de aire se generó con una bomba de jeringa New Era 1000. Se aplicó un flujo constante a través de cada muestra mientras se leía simultáneamente la presión para medir la acumulación de presión interna debido a la resistencia al flujo a través de la muestra.

Para medir la disolución de los NF de PVA, los NF se electrohilaron como se describe anteriormente sobre un sustrato de papel de aluminio unido al tambor de electrohilado Tong Li. Para generar NF cargados con colorantes visibles en lugar de antibióticos para el análisis de espectrofotometría, se agregaron colorantes al PVA a niveles de solubilidad acuosa asociados con cada fármaco (0,1 % de Direct Red 80 [Sigma Aldrich 365548) y 0,03 % de azul de metelino (Sigma Aldrich M9140)] y se centrifugó para obtener una masa de 20 µg/cm2. Ambos tintes se seleccionaron para imitar el tamaño molecular de los antibióticos (Fig. 1 complementaria). Todas las demás características de depósito se mantuvieron iguales. Las muestras se cortaron a medida utilizando un cortador láser PLS6MW con un láser de fibra de 40 W (1,06 μm). Para caracterizar la velocidad de disolución, se colocaron muestras de 0,3 cm2 en una placa de 96 pocillos y se expusieron a 300 μL de agua DI. Se retiró un conjunto de muestras después de 1 min, y cada muestra siguiente después de 2 min adicionales. A continuación, la solución se agitó para homogeneizar y se pipetearon muestras de 100 μl en otra placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia con un espectrofotómetro BMG ClarioSTAR PLUS. Se replicó un procedimiento similar para los experimentos de variación de pH, reemplazando el agua desionizada por solución tampón clara (Sigma-Aldrich) con valores de pH de 6, 7 y 8, y también para estudiar el efecto del grado de hidrolización, con P1763 PVA totalmente hidrolizado o 843.869 PVA parcialmente hidrolizado (MW = 70.000). Cada muestra se midió por triplicado.

La prueba de disolución de gel, utilizada para imitar las condiciones del lecho de la herida, se realizó utilizando gel de agarosa de baja temperatura de fusión disuelto en agua al 0,5 % p/p (Sigma-Aldrich). A continuación, la agarosa se pipeteó en muestras de 1 ml en una placa de 12 pocillos y se dejó reposar. Se cortaron círculos de 1 cm2 de NF azules (linezolida) sobre el sustrato de lámina de Al utilizando el cortador láser PLS6MW y se colocaron sobre la superficie del gel. El primer conjunto de muestras se eliminó después de 1 min, y luego cada muestra siguiente después de 2 min adicionales. A continuación, las muestras de gel con fibras disueltas se disolvieron mediante exposición al calor y se agitaron antes de extraer y pipetear muestras de 100 μl en una placa de 96 pocillos para lectura óptica utilizando BMG ClarioSTAR. Cada muestra se midió por triplicado.

Los aislados clínicos de P. aeruginosa (25668) y E. coli (25922), dos patógenos G-ve comunes que se encuentran en las SSTI, se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Todos los medios y antibióticos se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Los cultivos de bacterias se revivieron a partir de material congelado en una solución de caldo de soja tríptico (TSB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se incubaron durante la noche. Una muestra del stock revivido se diluyó 1:50 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lograr un inóculo inicial de aproximadamente 107 CFU/mL. Se pipetearon muestras de 50 μl en una placa de 96 pocillos de modo que se pudieran extraer tres pocillos nuevos de cada punto de medición. Se prepararon tres de estas placas y cada una se expuso a terapia de ozono a 2 mg/h, 4 mg/h y 8 mg/h a través del apósito permeable a los gases descrito anteriormente que consiste en una capa de membrana hidrófoba, una capa de dispersión interna y un respaldo de PDMS. . Se aplicó gas ozono continuamente durante 8 h a temperatura ambiente. Cada hora, se extrajeron muestras de 20 μl de tres pocillos y se diluyeron en serie para sembrarlas en placas de agar TSB.

Los experimentos de biocompatibilidad se adaptaron del procedimiento utilizado previamente por Kasi et al.66 La citocompatibilidad del tratamiento con ozono se analizó con células de fibroblastos NIH/3T3 (compradas a ATCC) mediante un ensayo colorimétrico controlado por enzimas, CellTiter 96 Aqueous One (Promega). La enzima usa ATP para impulsar la función de la enzima, por lo que solo las células vivas convierten el sustrato en el compuesto detectable en el espectrofotómetro. Las placas se cultivaron con células NIH/3T3 en medio DMEM con FBS al 10%. Para probar la citocompatibilidad, el ozono (2–8 mg/h) se expone a través de almohadillas a las células en el día 0. Había una suspensión de 5000 células/mL en cada pocillo. Se utilizaron 3 placas para estudiar la viabilidad celular para cada concentración. En cada placa se usaron 3 pocillos por duplicado. Las diferentes concentraciones de ozono se expusieron durante 6 h dentro de la cámara de cultivo celular (cámara de CO2, 37 °C). Las células sin tratamiento con ozono también se usaron como control. La suspensión de DMEM se aspiró de los pozos de prueba cada día y se cubrió con 200 µL de reactivo MTT. La proporción de reactivo a medio fue de 20:100 µL para un total de 200 µL para cubrir las muestras. Se permitió que las muestras unidas con células NIH/3T3 redujeran el sustrato durante 1 h. Luego, se transfirieron tres alícuotas de 100 µL a una placa de 96 pocillos. La absorbancia óptica de las muestras se leyó a una longitud de onda fija de 490 nm en el espectrofotómetro SpectraMax M2 (MolecularDevices, EE. UU.), que se calibró con un reactivo MTT en blanco. También se realizaron imágenes en vivo/muerto para estudiar la viabilidad celular en las diferentes exposiciones al ozono. Se usó la misma configuración mencionada anteriormente en el ensayo MTT para estudiar la viabilidad celular visual. Se cultivaron las células de fibroblastos NIH/3T3; se tomaron imágenes de las células vivas/muertas usando calceína-AM y homodímero de etidio - 1 en diferentes intervalos de tiempo como el día 1, 3 y 7. Las células NIH/3T3 se cultivaron como se mencionó anteriormente en el análisis MTT, y tres placas idénticas junto con control (sin tratamiento) se utilizaron para el estudio. Las células se capturan con los filtros respectivos en Nikon Ti2 Eclipse, equipado con una cámara bajo una lente óptica 10X usando el software NIS-Elements D.

Para probar los efectos antibacterianos del ozono en combinación con antibióticos, los mismos cultivos ATCC 25668 P. aeruginosa y ATCC 25922 E. coli se inocularon en una solución de caldo de soya tríptico (TSB, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se incubaron durante la noche. . Una muestra del cultivo maduro se diluyó en TSB nuevo a 1:500 (inóculo inicial de aproximadamente 106) para proporcionar los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano continuo durante la prueba para imitar mejor el entorno de la herida. Luego, el nuevo medio de cultivo se pipeteó en los pozos de prueba por triplicado a 1:10 con una solución de linezolida o vancomicina en agua desionizada a 2000 μg/mL. La solución final en cada pocillo tenía un volumen de 50 μL y una concentración de antibiótico de 200 μg/mL.

Las muestras bacterianas se sometieron al tratamiento combinado de 4 mg/h de ozono con vancomicina a 200 μg/mL y linezolid a 200 μg/mL. Esta concentración de antibiótico se seleccionó para proporcionar una concentración alta (10x) que permitiera la potencia suficiente del antibiótico para el tratamiento de cepas de bacterias normalmente resistentes41,67,68,69,70. Durante la prueba, las muestras de prueba se mantuvieron a 37 °C para garantizar que fuera posible un crecimiento bacteriano adecuado. A las 2, 4 y 6 h, se retiraron muestras de 20 μl del conjunto designado de pocillos y se sembraron en placas de agar TSB. Las colonias bacterianas se contaron después de incubarlas durante la noche a 37 °C. Las muestras experimentales de terapia complementaria se compararon con el tratamiento de solo ozono y cultivos de control expuestos a antibióticos sin ozono.

Los experimentos de biocompatibilidad de la terapia adjunta siguieron el procedimiento descrito anteriormente para la terapia con ozono66. En resumen, el tratamiento adjunto con ozono se analizó con células de fibroblastos NIH/3T3 adquiridas de ATCC utilizando el mismo ensayo colorimétrico. Las placas cultivadas que contenían células a 5000 células/mL se analizaron con 4 mg/h de ozono y 200 μg/mL de vancomicina o 200 μg/mL de linezolid el día 0 y se compararon con células sin ningún tratamiento. El tratamiento combinado se expuso durante 6 h dentro de la cámara de cultivo celular a 37 °C. Se añadió ensayo MTT a 20:100 µL en cada muestra y se dejó reducir el sustrato durante 1 h. Se transfirieron tres muestras de 100 µL a una placa de 96 pozos para mediciones de absorbancia óptica a 490 nm utilizando el espectrofotómetro. Además, las muestras se expusieron a imágenes en vivo/muerto después de 1, 3 y 7 días y se compararon con los resultados del control. Las imágenes de tinción se tomaron usando una lente óptica de 10x.

Se utilizó una prueba ANOVA de una vía para determinar la significación estadística de las muestras (α = 0,05) para las pruebas antibacterianas. Posteriormente se realizó la prueba de Dunnet para comparación múltiple para verificar la diferencia estadística entre diferentes condiciones y puntos de tiempo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer al personal del Centro de Nanotecnología Birck de la Universidad de Purdue por su asistencia durante todo el proyecto, junto con el Departamento de Ingeniería Mecánica de Purdue y el Departamento de Ingeniería de Materiales de Purdue.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Purdue, West Lafayette, EE. UU.

Alejandro Roth

Centro de Nanotecnología Birck, West Lafayette, EE. UU.

Alexander Roth, Sina Nejati, Akshay Krishnakumar, Vidhya Selvamani, Sotoudeh Sedaghat y Rahim Rahimi

División de Farmacoingeniería y Farmacia Molecular, Escuela de Farmacia Eshelman, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, EE. UU.

Murali Kannan Maruthamuthu y Juliane Nguyen

Departamento de Ingeniería de Materiales, Universidad de Purdue, West Lafayette, EE. UU.

Sina Nejati, Vidhya Selvamani, Sotoudeh Sedaghat y Rahim Rahimi

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de Purdue, West Lafayette, EE. UU.

Akshay Krishnakumar

Departamento de Ciencias Biomédicas y Patobiología, Virginia Tech, Blacksburg, EE. UU.

Mohamed N. Seleem

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AR realizó la fabricación, la caracterización y las pruebas antibacterianas. SN y AK ayudaron en las pruebas antibacterianas. SS realizó imágenes SEM. VS y MKM contribuyeron en el procedimiento de biocompatibilidad. JN y MS proporcionaron orientación y retroalimentación microbiológica. RR proporcionó supervisión y orientación de ingeniería.

Correspondencia a Rahim Rahimi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Roth, A., Maruthamuthu, MK, Nejati, S. et al. Sistema portátil de ozono y terapia antibiótica adjunto para el tratamiento de infecciones bacterianas dérmicas Gram-negativas. Informe científico 12, 13927 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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Recibido: 25 de marzo de 2022

Aceptado: 26 julio 2022

Publicado: 17 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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