Biosíntesis novedosa de NP de MnO utilizando Mycoendophyte: estrategias de bioprocesamiento industrial y escalado

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2052 (2023) Citar este artículo

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Este informe proporciona la primera descripción de la micosíntesis de NP de MnO en forma de varilla con un tamaño de cristalito promedio de ~ 35 nm, empleando metabolitos bioactivos extracelulares de la cepa endófita Trichoderma virens EG92 como agentes reductores/protectores y MnCl2·4H2O como componente principal. . El medio de salvado de trigo se eligió para cultivar la cepa endófita EG92, que produjo una variedad de metabolitos bioactivos en la fracción extracelular, lo que aumenta el rendimiento de MnO NP a 9,53 g/l. Todas las condiciones de crecimiento del medio y hongos que influyeron en la generación de biomasa se optimizaron como enfoques de optimización estadística sucesiva (diseños de Plackett-Burman y Box-Behnken). Las mejoras de producción se lograron a pH 5,5, WBE (35 %) y tamaño de inóculo (10 %), lo que incrementó Xmax a doce veces (89,63 g/l); por tanto, Pmax aumentó hasta ocho veces (82,93 g/l). Después de 162 h, Xmax (145,63 g/l) y Pmax (99,52 g/l) del lado de µmax e YX/S se determinaron como 0,084 y 7,65, respectivamente. A través del diseño experimental de Taguchi, se mejoró la reacción de las NP de MnO fabricadas con hongos mediante la adición de 0,25 M de MnCl2·4H2O al 100 % del extracto fúngico (agentes reductores/de protección) y ajustando el pH de la reacción a ~ 5. Esta reacción se incubó a 60 ° C durante 5 h antes de agregar 20% de extracto fúngico (agente estabilizador). Además, Pmax se elevó 40 veces (395,36 g/l) sobre el BC. Nuestras NP de MnO micosintetizadas exhiben acciones antagónicas más rápidas y precisas contra las bacterias fitopatógenas que los hongos; podrían emplearse como nano-bio-pesticida alternativo y prometido para manejar una variedad de diferentes tipos de enfermedades-patógenos en el futuro.

En la actualidad, la aplicación de la nanotecnología está aumentando exponencialmente en diferentes actividades terapéuticas y agrícolas, como antibióticos, anticancerígenos, agentes antimicrobianos y biofertilizantes1. Uno de los retos de la nanotecnología moderna es el desarrollo de protocolos fiables y seguros para la síntesis de nanopartículas. Se han visto diferentes técnicas físicas y químicas en la síntesis de tantas nanopartículas y nanoestructuras. Recientemente, estas metodologías fueron reportadas como métodos peligrosos y costosos debido a la dependencia de sustancias inseguras que podrían causar riesgos potenciales para el ecosistema2. Por lo tanto, la exploración de enfoques sostenibles innovadores, rentables, no tóxicos y ecológicos debería ser de gran interés. Por lo tanto, la nanotecnología verde ha sugerido desarrollar técnicas rentables y ambientalmente sostenibles para fabricar nanopartículas metálicas.

Hay muchas nanopartículas de metales y óxidos metálicos como las nanopartículas de Ag, Au, Fe2O3, CaO, MgO, TiO2, ZnO y CuO que diferentes fuentes biológicas han biosintetizado3,4,5,6,7. Los hongos, las bacterias, las plantas e incluso las algas se pueden usar de manera efectiva como una fábrica ecológica para fabricar nanopartículas que tienen inmensas aplicaciones potenciales, especialmente en los sectores biomédico y agrícola8,9,10. Por lo tanto, la síntesis verde de nanopartículas puede controlarse mediante los metabolitos bioactivos producidos, como proteínas, aminoácidos, carbohidratos, alcaloides, fenoles e incluso enzimas que se utilizan como agentes reductores y estabilizantes. Pero varias fuentes biológicas no pudieron ser aplicadas en sectores agrícolas debido a sus propiedades patógenas. Por lo tanto, es muy plausible que se utilicen moléculas bioactivas seguras que puedan extraerse de células biológicas seguras2,11. Hay varios microorganismos aislados de la rizosfera (microbios del suelo) que han sido ampliamente expuestos como sintetizadores de nanopartículas, pocos informes sobre endófitos (microbios de tejidos vegetales). Por lo tanto, es importante centrarse en estas rutas biológicas prometedoras de nanofábricas que produjeron diferentes nanopartículas metálicas con tamaños y formas atractivos para diferentes aplicaciones biológicas, incluidas propiedades antimicrobianas, citotóxicas y antioxidantes12,13. Los microorganismos como las bacterias, los actinomicetos y los hongos que viven dentro de los tejidos o células de las plantas sin provocar ningún daño en su huésped se denominan endófitos. Consideraron candidatos atractivos para abrir una nueva línea de sistemas de biosíntesis profesionales vinculados a la biología y la nanotecnología. Este enfoque es rentable, ambientalmente sostenible y puede proporcionar nanopartículas con un tamaño y una forma mejor especificados sin muchos iones metálicos14,15. Los hongos endófitos (micoendofitos), especialmente Trichoderma spp., están produciendo una amplia variedad de nuevos metabolitos bioactivos seguros (flavonoides, alcaloides, polisacáridos y enzimas) que podrían usarse como una fuente potencial para producir nanopartículas por métodos intracelulares y extracelulares. Porque las moléculas bioactivas intra y extracelulares secretadas desempeñan el papel principal en la biosíntesis de nanopartículas (enfoque ascendente) al reducir las sales metálicas y luego los iones metálicos. El método de fabricación ecológico de nanopartículas mediado por hongos tiene muchas ventajas, como la simplicidad con la que el proceso de fermentación se puede escalar, el procesamiento posterior, además de la rentabilidad de una línea de producción de biomasa y el potencial para fabricar nanopartículas de manera eficiente. . Por lo tanto, una variedad de hongos filamentosos se han aplicado con eficacia para la biosíntesis extracelular e intracelular de diferentes metales y nanopartículas de óxidos metálicos3,16.

Varios informes están interesados ​​en la biosíntesis o (síntesis verde) de MnO NP utilizando extractos de plantas y bacterias; sin embargo, ningún estudio informa la biosíntesis de MnO NP utilizando los metabolitos bioactivos extraídos de hongos, especialmente cepas micoendofíticas. En este documento, la aplicación de células fúngicas como un candidato productor verde para la biofabricación de nanopartículas ha ganado un interés significativo en la comunidad de nanobiotecnología. Además, para la biosíntesis de nanopartículas a escala industrial, se optimizaron varios parámetros fisicoquímicos, además de todas las condiciones de cultivo microbiano, para producir NP de MnO homogéneas, con actividad antimicrobiana satisfecha. Por lo tanto, todos los objetivos anteriores se estudiaron estadísticamente con éxito para obtener la línea de producción industrial de MnO NP utilizando uno de los endófitos competentes.

Según los campos de aplicación, la nanotecnología involucra varios enfoques para materiales de nanoestructuras, como técnicas físicas, químicas y biológicas. Dado que el método de fabricación biológica surgió como una técnica ecológica prometedora para superar los efectos secundarios que acompañan a los métodos de fabricación físicos y químicos8. Así, recientemente apareció la nueva rama de la nanotecnología denominada nano-biotecnología, donde se fabricaron nanopartículas biológicamente utilizando metabolitos bioactivos extraídos de entidades biológicas como plantas, algas, bacterias y hongos1,9,10,17. Este método biológico se considera una técnica comercialmente viable, limpia, ecológica y no tóxica para fabricar algunas nanopartículas aplicadas en medicina y agricultura12,18. Para ampliar las nanopartículas fabricadas, una nueva expresión que apareció en la nanotecnología se denominó "nanotecnología industrial". Hoy en día, la fabricación a gran escala de nanopartículas es un requisito obligatorio para el desarrollo de varias industrias sin destruir la salud humana y el medio ambiente utilizando sustancias tóxicas o alta energía15,19. Así, apareció el nuevo campo científico prometedor denominado nano-biotecnología industrial. El proceso biológico rentable se aplicó para reducir los problemas de riesgos para la salud y las desventajas ambientales como se informa en el presente trabajo.

En tiempos recientes, las células fúngicas fueron descubiertas como potentes biofábricas para la fabricación de algunas nanopartículas porque tienen varios metabolitos bioactivos. Dado que la mayoría de los hongos requieren una pequeña cantidad de nutrientes, son fáciles de manipular y se pueden filtrar, los hongos son preferibles a otras células biológicas debido al ahorro de costos de inversión considerables para la fabricación de nanopartículas3. El micoendofito (endosimbionte) inhibe los tejidos vegetales sin destruir las células huésped. Durante las últimas décadas, estos micoendofitos han sido objeto de gran atención debido a que producen una cantidad ilimitada de metabolitos bioactivos, como fenol, esteroides, flavonoides, péptidos, etc20,21,22. Estos micoendofitos están relativamente inexplorados como fuente potencial de metabolitos bioactivos mixtos que se utilizan para la biosíntesis de nanopartículas1,8. Si bien, un agente antimicrobiano prometedor podrían ser los metabolitos orgánicos; por ejemplo, enzimas o compuestos inorgánicos como metales dependiendo de sus actividades antimicrobianas de amplio espectro y la tolerancia de las condiciones de procesamiento industrial a gran escala5. Recientemente, las nanopartículas de óxidos metálicos se exploraron como una clase potencial de agentes antimicrobianos debido a sus posibles aplicaciones en la seguridad alimentaria según su forma, tamaño, estabilidad y propiedades superficiales16,23,24. En particular, las NP de MnO tienen propiedades físicas, químicas, eléctricas, magnéticas y catalíticas distintivas significativas, que preocuparon ampliamente a los intereses de las investigaciones. La mayoría de los informes científicos se centraron en la estimación de propiedades químicas, físicas y catalíticas además de la aplicación de NP de MnO utilizando sus propiedades electrónicas y actividades catalíticas; sin embargo, sus actividades antimicrobianas rara vez se investigaron24. Varios informes están interesados ​​en la biosíntesis o (síntesis verde) de MnO NP utilizando extractos de plantas y bacterias; sin embargo, ningún estudio reporta la biosíntesis de NPs de MnO utilizando los metabolitos bioactivos extraídos de hongos, especialmente cepas micoendofíticas25. Por lo tanto, explorar MnO NP micosintetizados utilizando biofábricas potenciales seguras, baratas y más simples, como Trichoderma sp., Posee nuevas actividades antimicrobianas consideradas una aplicación moderna competente en muchos campos, especialmente en los sectores agrícolas. En este documento, se usaron diferentes aislamientos micoendofíticos para sintetizar MnO NP, ya que la reacción fabricada final se reconoció fácilmente a través de su cambio de color de amarillo a marrón rojizo. Posteriormente, las NP de MnO fabricadas se probaron como agente antimicrobiano contra fitopatógenos y luego se seleccionó el aislado competente que produjo las NP de MnO más efectivas como agente antimicrobiano. Ya que las actividades antibacterianas más prometedoras (P ≤ 0,05) se registraron contra bacterias fitopatógenas como Erwinia amylovora (34,0 ± 2,69 mm) seguida de Acetobacter pasteurianus (30,0 ± 2,45 mm) y Erwinia persicina (28,5 ± 5,4 mm). Además, las NP de MnO micosintetizadas se probaron como agente antifúngico, y las actividades antifúngicas más altas se midieron contra Aspergillus flavus (24,5 ± 3,20 mm) y Aspergillus niger (20,5 ± 2,06 mm), seguido de Fusarium solani (19,25 ± 3,26 mm) como se muestra en la Tabla 1. Como resultado, el aislado elegido se identificó genéticamente usando los datos de la secuencia de ADNr dados usando el análisis GenBank Blast. Este aislado se envió a la base de datos GenBank como cepa endófita de Trichoderma virens EG92 con el número de acceso MF429775 porque era completamente similar a Trichoderma virens, como se ve en la Fig. 1.

Árbol filogenético y diversidad de secuencias parciales de genes de ARN ribosomal de subunidades pequeñas y grandes (espaciador interno transcrito 1, gen de ARN ribosomal 5.8S y espaciador interno transcrito 2) en la cepa endófita Trichoderma virens EG92 (MF429775) en comparación con las cepas de referencia. Este árbol se construyó utilizando la unión de vecinos y el análisis de máxima verosimilitud (software MEGA10.1.7 2020). La divergencia de la secuencia se indica mediante una barra de escala.

En este estudio, las NP de MnO micosintetizadas se detectaron por primera vez a simple vista cuando el color de la reacción cambió de suspensión amarilla a marrón amarillento y marrón rojizo, como se presenta en la Fig. 2B, C; debido a la excitación de las vibraciones del plasma superficial26. Además, los picos de intensidad de absorción UV-Vis aumentan con la absorbancia máxima a 350 nm, lo que confirma la micosíntesis de MnO NP como se muestra en la Fig. 2A. Por lo tanto, el color de la reacción y el espectro UV-Vis indican que la micosíntesis de NP de MnO bien reducidas/estabilizadas se completó con éxito. La espectroscopia UV-Vis es la técnica más utilizada para examinar las propiedades ópticas de las nanopartículas producidas mediante la detección del pico de absorción amplio18,27. Según los informes anteriores, los espectros de absorción UV-Visible de las NP de MnO oscilaron entre 284 y 400 nm debido a las transiciones n → π⃰ y π → π⃰11,24,25. Además, diferentes picos de absorción de MnO NP indicaron una diferencia en las variaciones de forma y tamaño de las nanopartículas fabricadas según el método de síntesis1,10.

(A) Los espectros UV-Vis de NP de MnO fabricados con hongos muestran un pico de resonancia de plasmón superficial a 350 nm, (B) Los NP de MnO fabricados finales, (C) El extracto de la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítico y (D) Imagen SEM de Las NP de MnO fabricadas con hongos muestran su estructura en forma de varilla.

Anteriormente, las diferentes formas y tamaños de las nanopartículas sintetizadas dependían de agentes reductores/protectores6,25. Por lo tanto, SEM se utilizó para analizar los caracteres morfológicos de nuestros MnO NP micosintetizados. El carácter morfológico de las NP de MnO fabricadas se detectó mediante investigación SEM (Fig. 2D), que muestra la aglomeración que se produjo durante la reacción de biosíntesis. La imagen SEM muestra una NP de MnO formada muy claramente en la morfología en forma de barra. Además, su composición elemental se determinó mediante análisis EDX, que muestra una fuerte y varias señales de Mn junto con una señal de O, que podría haberse originado a partir de los metabolitos bioactivos (materiales orgánicos que recubren) (Fig. 3A). Además, el perfil EDX muestra las NP de MnO micosintetizadas como un contenido de alta pureza compuesto por Mn (64,45 %) y O (35,5 %).

Caracterización de NP de MnO fabricadas con hongos utilizando extracto endófito de la cepa EG92 de Trichoderma virens mediante análisis EDX (A), perfil térmico TGA (B) y análisis XRD (C).

La figura 3B muestra el perfil térmico de TGA de NP de MnO sintetizadas por mico, que se probaron a diferentes temperaturas hasta 800 °C. La pendiente resultante de la curva TGA muestra una pequeña pérdida de peso de alrededor del 5,5 % observada a 815 °C, que podría deberse a la liberación de agua, metabolitos bioactivos recubiertos y sin reaccionar que rodeaban la superficie de las NP de MnO sintetizadas por mico. Además, el patrón XRD de NP de MnO micosintetizadas usando la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítico está completamente cerrado al patrón estándar de α-MnO tetragonal centrado en el cuerpo (archivo JCPDS No.44-0141), que confirmó que la producción de NP de MnO es logrado con éxito (Fig. 3C). Los picos de difracción agudos se detectaron en 2θ de 18,56°, 28,90°, 37,34° y 63,74°, indexados en (200), (310), (211) y (512) facetas, respectivamente. A través de los patrones XRD, el tamaño promedio de los cristalitos para las NP de MnO sintetizadas por mico se calcula utilizando la fórmula de Scherrer como 35 nm.

Todos los endófitos produjeron diferentes metabolitos secundarios (flavonoides, terpenoides, azúcares, cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos, etc.) para proteger a sus huéspedes contra depredadores y condiciones de estrés25,28. Estos metabolitos bioactivos podrían ser responsables de la reducción de nanopartículas18,29. Por lo tanto, se analizaron los fitoquímicos extraídos de la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítica probada. La espectroscopia FTIR se utilizó para identificar los metabolitos bioactivos en el extracto fúngico que participan como agentes reductores y estabilizantes en la reacción de fabricación de MnO NP; como se muestra en la figura 4A. Desde la posibilidad de biomoléculas responsables de tapar/estabilizar las NP de MnO sintetizadas por mico; especialmente bajo contenido de materias inorgánicas y orgánicas que se detectan mediante análisis FTIR. Los picos de absorción agudos se observaron en ν 3921 cm−1 (vibración de estiramiento O–H), ν 2117 cm−1 (vibración de estiramiento C–C), ν 1639 cm−1 (C = vibración de estiramiento), ν 1107 cm−1 (vibración de deformación de CH3), ν 1064 cm−1 (grupo amina), ν 962 cm−1 (un grupo aromático), ν 759 cm−1 (vibración de deformación de CH2), ν 644 cm−1 (grupo –OH), y ν 437 cm−1 (vibración del esqueleto C–C). Estos indican que diferentes grupos funcionales podrían estar involucrados en las NP de MnO sintetizadas por mico.

Espectros FTIR del extracto de la cepa EG92 (A) de Trichoderma virens endofítico y las NP de MnO fabricadas con hongos (B).

En la Fig. 4B, diferentes bandas FTIR desaparecieron en espectros biosintetizados, como ν 1325, 1209 y 1107 cm−1 asignados a las vibraciones de los grupos O–H, O–H–O y CH3. Además, la banda ha aparecido en ν 1410 cm−1, lo que indica la presencia de vibración de deformación C–H. Entonces, estos cambios en el espectro FTIR podrían reconocerse como los grupos activos utilizados para completar la biosíntesis de MnO NP. Mientras que las vibraciones de flexión de meta-oxígeno Mn-O-Mn de MnO NP micosintetizadas también se identificaron en bandas por debajo de ν 750 cm-1, registradas en ν 615 y 516 cm-1. La presencia de fenoles, alcaloides, carbohidratos, aminoácidos y biomoléculas de proteínas en el extracto fúngico y las NP de MnO sintetizadas por micosis podría ayudar a convertir los iones de Mn en NP de MnO y recubrirlas con un escudo de varias biomoléculas, de acuerdo con los picos observados y resultados de análisis fitoquímicos.

Las células fúngicas normalmente producen metabolitos importantes que convierten las materias tóxicas en materias no tóxicas. Estos metabolitos podrían ser responsables de la biofabricación de nanopartículas ya que algunas moléculas bioactivas juegan un papel clave en este método30,31,32. En general, las células fúngicas se utilizaron para sintetizar nanopartículas de forma extracelular e intracelular, especialmente los hongos endófitos que secretan muchos metabolitos bioactivos, como proteínas y polipéptidos fitoquímicos, y enzimas fuera de las hifas y otras que quedan atrapadas en las células33. En comparación con otros microbios, los hongos endófitos tienen mayor tolerancia y capacidad de unión a sales metálicas; por lo tanto, estas células fúngicas tienen una ventaja para la producción a gran escala de nanopartículas, incluidos los procesos posteriores eficientes y de bajo costo. Además, otros informes revelaron que los hongos endófitos tienen una cinética más lenta, por lo que la forma y el tamaño de las nanopartículas producidas tienen estabilidad a largo plazo, especialmente las producidas extracelularmente31. Aquí, la reacción de biosíntesis de MnO NP a través de la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítico dependía de sus metabolitos bioactivos producidos utilizados como agentes reductores/tapadores y estabilizadores. El cultivo de la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítico se estudió utilizando diferentes medios fúngicos industriales para maximizar su producción de metabolitos bioactivos, como se muestra en la Fig. 5.

Diferentes medios que se seleccionaron para el cultivo de la cepa EG92 de Trichoderma virens endofítico para fabricar MnO NP. Medio Czapek-Dox (CDM), Medio de malta de levadura (YMM), Medio sintético (SM), Medio de harina de soja con glucosa (GSM), Medio de glucosa de levadura (YGM) y Medio de salvado de trigo (WBM).

La cepa endófita Trichoderma virens EG92 se cultivó bien utilizando todos los medios probados (CDM, YMM, SM, GSM, YGM y WBM). Sin embargo, el medio competente fue WBM, que produjo el peso de masa celular más alto (6,91 g/l) y el rendimiento de NP de MnO (9,53 g/l), seleccionado para estudios posteriores. Posteriormente, los metabolitos bioactivos producidos se diferenciaron en fracciones citoplásmicas y extracelulares fúngicas para detectar el compartimento celular competente utilizado para maximizar el peso de masa de MnO NP (Tabla 2).

La cepa endofítica cultivada EG92 usando WBM produjo alcaloides y fenoles, y bajas cantidades de carbohidratos totales (14,69 mg/µl) y proteína total (12,65 mg/µl) en una fracción citoplasmática que solía fabricar MnO NP (2,03 g/l) . Mientras que la fracción extracelular probada tiene diferentes metabolitos bioactivos como alcaloides, taninos, fenoles, esteroides y terpenoides, así como cantidades de carbohidratos totales (21,65 μg/ml) y proteínas totales (16,3 mg/μl) que produjeron 9,53 g/l. de NP de MnO. Finalmente, se eligió WBM para cultivar la cepa endofítica EG92 que produjo diferentes metabolitos bioactivos en fracciones extracelulares, maximizando el rendimiento de MnO NP a 9,53 g/l. El cultivo de cepas de Trichoderma utilizando extracto de salvado de trigo fue fuertemente respaldado por informes anteriores34,35. Dado que la materia orgánica extraída de los desechos agrícolas generalmente se usaba como una fuente de nutrientes no peligrosa, rentable y rica para cultivar células microbianas, especialmente células fúngicas. Los extractos de salvado de trigo mostraron una gran cantidad de proteínas, aminoácidos, elementos y carbohidratos disponibles, por lo que se informó anteriormente como un medio de crecimiento calificado para el cultivo de bajo costo de Trichoderma spp. usando fermentación en estado sólido; sin embargo, solo se ha utilizado en raras ocasiones en un sistema de fermentación sumergido36.

Hasta ahora, se han aplicado varios enfoques para las estrategias de optimización, como una variable a la vez (OVAT) y diseños estadísticos de experimentos (DOE)19,25,37. La estrategia OVAT se considera un método no eficiente y lento porque todas las variables se estudiaron por separado ignorando las interacciones entre estas variables. Sin embargo, los enfoques DOE podrían superar estos problemas y reducir el número de ensayos y el error experimental. La mayoría de los investigadores utilizaron ampliamente los diseños de Plackett-Burman, luego Box-Behnken para optimizar las variables probadas. En nuestros intentos, se utilizó el método OVAT para reducir el rango operativo de todas las variables testiculares y luego se aplicó DOE. Como se muestra en la Fig. 6, se estudiaron los factores que afectaron las cantidades de nutrientes solubles extraídos utilizando polvo de salvado de trigo para maximizar la biomasa de la cepa endófita EG92 y los rendimientos de MnO NP. Dado que el peso de salvado de trigo optimizado fue de 50 g/l, eso afectó el peso de la masa de células fúngicas producidas (10,06 g/l) y las NP de MnO (13,4 g/l), como se muestra en la Fig. 6A.

Condiciones efectivas de extracción de nutrientes solubles del polvo de salvado de trigo que afectaron la producción de biomasa endófita Trichoderma virens cepa EG92 y luego la fabricación de MnO NP.

Además, el peso máximo de la masa de células fúngicas (10, 5 g / l) y las NP de MnO (14, 3 g / l) se registraron después de 24 h del proceso de extracción (Fig. 6B). Al mismo tiempo, el pH de la solución de extracción se ajustó a un valor diferente, como 6, 7 y 8 (Fig. 6C), para distinguir el pH adecuado para maximizar los nutrientes solubles extraídos del polvo de salvado de trigo utilizado para hongos. cultivo. En este caso, el peso máximo de masa celular fúngica (10,3 g/l) y las NP de MnO (13,3 g/l) se detectaron a pH 6. Además, la temperatura óptima utilizada para la extracción de WB se determinó a 50 °C, lo que produjo la peso máximo de masa de células fúngicas (11, 5 g / l) y MnO NP (14, 9 g / l) como se muestra en la Fig. 6D. Posteriormente, se prepararon las condiciones suficientes para extraer los nutrientes solubles del salvado de trigo mezclando 50 g de salvado de trigo con 1 l de agua destilada y ajustando el pH a 6 y calentando a 50 °C durante 24 h. En esta condición, el peso máximo de la masa de células fúngicas y las NP de MnO se registraron en aproximadamente 15,3 g/l y 22,35 g/l, respectivamente; que aumentó dos veces más que las condiciones basales (BC).

La optimización de los ajustes de fermentación es una restricción crítica para mejorar la economía de las biorrefinerías. La metodología de superficie de respuesta (RSM) es un enfoque estadístico aplicado para optimizar y modelar varias variables. Se utilizó para determinar las condiciones óptimas del proceso mediante la integración de los diseños experimentales con interpolación utilizando la primera o la segunda ecuación polinomial38,39,40. En este trabajo, el diseño de Plackett-Burman se empleó por primera vez para mejorar las condiciones de cultivo de la cepa endofítica EG92 mediante la detección estadística de las variables significativas. La Tabla 3 resume las variaciones en el peso de la masa de células secas de 20,3 a 41,30 g/l, lo que refleja la importancia de investigar las condiciones de cultivo para optimizar la mayor productividad de biomasa. El coeficiente de determinación del modelo (R2) señala que el 97,73% de la variabilidad de la respuesta podría ser descrita por este modelo, mientras que el 2,27% de la variación total no puede ser descrita.

Además, el F-ratio calculado fue mayor que el teórico para el modelo de regresión, lo que indica su significación (Tabla 4). Los efectos principales calculados se graficaron como un gráfico como se muestra en la Fig. 7A. Dado que todas las variables afectan positivamente al peso de la masa de células secas, excepto la agitación, el pH y el CuSO4, tienen efectos negativos. Además, diferentes variables significativas tienen la mayor contribución de presencia en este gráfico circular, como F3 (14%), F8 (22%) y F6 (45%); por lo tanto, estos factores se consideran variables importantes para aumentar la producción de peso de masa de células secas final para la cepa endofítica EG92 (Fig. 7B).

Análisis estadístico que muestra los efectos de las variables probadas en la masa de células secas de la cepa EG92 de Trichoderma virens entofítico según el diseño de Plackett-Burman. (A) Gráfico de columnas del efecto principal calculado de las variables probadas, (B) Gráfico circular de distribución porcentual de cada variable y (C) Gráfico de Pareto que representa el valor p calculado y los niveles de confianza.

Además, el diagrama de Pareto graficado muestra la clasificación de cada variable estimada utilizando el nivel de confianza (%) y el valor p (Fig. 7C). Las variables significativas y no significativas se detectaron simplemente por el nivel de confianza calculado (%) ya que las variables significativas tienen niveles de confianza de hasta el 95%, como la edad del inóculo (98,11%), el pH (99,4%), el tamaño del inóculo (99,96%). , y WBE (99,79%). Finalmente, esta mejora se logró a la edad de los inóculos (48 h), agitación (150 RPM), pH 6, CuSO4 (0.01 g/l), temperatura de incubación (30 °C), WBE (30%), glucosa (10 g/l). l), tamaño de inóculo (4%) y MgSO4 (0,1 g/l). Estas condiciones aumentaron la masa máxima de células secas de la cepa endofítica EG92 hasta seis veces (42,68 g/l) que con el BC. Posteriormente, los metabolitos bioactivos fúngicos se utilizaron para fabricar NP de MnO que aumentan hasta cinco veces (55,29 g/l).

En segundo lugar, los tres factores independientes seleccionados (pH, WBE y tamaño de los inóculos) se optimizaron estadísticamente a través del diseño de Box-Behnken para producir el peso máximo de biomasa fúngica. Ya que los niveles de las variables más significativas variaron de valores bajos (-), medios (0) y altos (+), mientras que las variables no significativas se estabilizaron en sus valores. La Tabla 5 representa la matriz de diseño para las variables probadas que indican tanto los valores codificados como los reales además de los pesos de masa de células secas experimentales y pronosticados. La optimización de las variables significativas que afectan los pesos de la masa de células secas se logró a través de la ecuación de regresión que generó relacionar la variable de respuesta con niveles codificados de variables independientes (Tabla *8). Estos resultados muestran que tres variables independientes aumentan significativamente las cantidades de masa celular seca. Dado que existe una variación en el peso de la masa de células secas de 58,18 g/l (pista 2) a 86,89 g/l (pista 13). Este modelo es significativo a un alto nivel de confianza porque el valor F fue varias veces mayor que el tabulado. El valor p de probabilidad también fue muy bajo (p ≤ 0,05). El coeficiente de determinación del modelo (R2) señala el 96,47% de la variabilidad de respuesta que este modelo podría designar. A su vez, no se puede definir el 3,53% de la variación total (Cuadro 6). La alta correlación (Adj. R2 = 0,90) también indicó el grado de precisión que confirmó la alta significación del modelo.

Además, se graficó el gráfico de Pareto (Fig. 8A) utilizando el nivel de confianza (%), y los valores de p mostraron los rangos de cada variable; ya que las variables significativas tienen niveles de confianza de hasta el 95%. ANOVA determinó la contribución porcentual de cada variable y las interacciones entre las variables probadas. La figura 8B muestra la mayor contribución de presencia de diferentes variables, que se registraron en X22 (40 %), seguido de X32 (23 %) y X12 (8 %). Además, la mayor presencia contribuyó a los efectos de interacción de las variables significativas se registró entre X2X3 (16 %) y X1X2 (6 %). Por lo tanto, estas variables y su combinación son importantes para mejorar el peso de la masa de células secas producidas para la cepa endofítica EG92. Se ajustó un modelo polinomial de segundo orden mediante la Ec. (4), y los valores reales se calcularon utilizando la ecuación. (5) para predecir el punto óptimo. En conclusión, esta mejora se logró a pH 5,5, WBE (35 %) y tamaño de inóculo (10 %), lo que incrementó la masa máxima de células secas de la cepa endófita EG92 hasta 12 veces (89,63 g/l) que con BC . Posteriormente, los metabolitos bioactivos fúngicos se utilizaron para fabricar NP de MnO que aumentaron hasta 8 veces (82,93 g/l).

Análisis estadístico de los efectos de las variables significativas probadas sobre la masa de células secas de la cepa EG92 de Trichodermavirens entofítico, según el diseño experimental de Box-Behnken. (A) El gráfico de Pareto representa el valor p calculado y el nivel de confianza (%), y (B) El gráfico circular muestra la distribución porcentual de cada variable.

En este trabajo, el sistema de fermentación sumergida se utilizó para estudiar la cinética de crecimiento de la cepa endofítica EG92 a través del modo de fermentación por lotes dentro de un biorreactor de 7 L. Dado que el sistema de fermentación sumergida se consideraba un proceso simplista que proporcionaba un mejor control. Mientras tanto, el aumento de la producción de hongos filamentosos estuvo influenciado por muchos parámetros como la velocidad de agitación y las tasas de flujo de aire. Por lo tanto, para maximizar la tensión endofítica, el peso de la masa de células secas EG92 obtiene el mejor rendimiento de MnO NP. Las características de mezcla de diferentes velocidades de aireación/agitación y tiempos se estudiaron a través de siete estrategias de control en modos de fermentación por lotes (BF) (Fig. 9). Los resultados de la cinética mostraron variaciones en Xmax y Pmax, lo que indicó las actividades fisiológicas más altas dependiendo de las diferentes velocidades y tiempos de aireación/agitación. Como se muestra en la Fig. 9, el régimen de aireación/agitación utilizado en el caso B6 (flujo de aire y agitación ajustados para permitir que el nivel de OD no fuera inferior al 40 %) produjo los valores más altos de Xmax (145,63 g/l) y Pmax (99,52 g/l) después de 162 h por el lado de μmax y YX/S se registraron como 0,084 y 7,65, respectivamente. Por lo tanto, el ajuste del nivel de OD a ≥ 10 % se considera un factor importante que afecta el crecimiento de la cepa endófita EG92, que aumenta hasta un 21,08 % (145,63 g/l) que la BC. Posteriormente, las NP de MnO fabricadas utilizando estas concentraciones de metabolitos bioactivos aumentaron hasta diez veces (99,52 g/l) que la concentración basal del agente reductor/protector. En el punto final del modo de fermentación por lotes, las cuatro estrategias de alimentación probadas se iniciaron mediante diferentes modos de fermentación por lotes alimentados. Estos cuatro modos de fermentación por lotes alimentados (FBF) probados fueron establecidos por los ingredientes medios optimizados o WBE, solo para aumentar la producción de crecimiento fúngico. Como se muestra en la Fig. 10, se utilizaron diferentes estrategias de alimentación para explicar el comportamiento de las células EG92 de la cepa endofítica y las NP de MnO producidas. Los datos más altos se registraron alimentando WBE a través del régimen de alimentación de pulsos exponenciales (FB4). Dado que, Xmax y Pmax se registraron como 295,36 y 217,95 g/l, respectivamente, después de 48 h en μmax (0,082) y YX/S (20,69). Estos resultados se consideran únicos en el sentido de que maximizan la producción de biomasa endofítica de Trichoderma y, por lo tanto, la biosíntesis de MnO NP utilizando material de desecho, lo que nunca antes se había hecho hasta donde sabemos.

Efectos de diferentes regímenes de aireación y agitación y su tiempo en el crecimiento de la cepa EG92 de T.virens endofítico, por lo tanto, el peso de masa de MnO NP fabricado utilizando un sistema de fermentación sumergido a través del modo por lotes dentro de un biorreactor de 7 L. (B1); el flujo de aire comenzó de 1 a 4,5 vvm/12 h y la agitación comenzó de 100 a 800 rpm/6 h, (B2) el flujo de aire comenzó de 0,5 a 2 vvm/6 h y la agitación comenzó de 100 a 800 rpm/3 h, (B3) flujo de aire comenzó de 1,5 a 3,5 vvm/12 h y la agitación comenzó de 50 a 250 rpm/6 h, (B4) el flujo de aire comenzó de 0,5 a 2,5 vvm/6 h y la agitación constante a 400 rpm, (B5) el flujo de aire constante a 2 vvm/ 12 h y la agitación comenzó de 50 a 300 rpm/6 h, (B6) el flujo de aire y la agitación se ajustaron para que el nivel de O2 disuelto no fuera inferior al 10 %, y (B7) el flujo de aire y la agitación se ajustaron para que el nivel de O2 disuelto no fuera inferior al 10 %. 40%.

Estudie los efectos de diferentes modos de fermentación por lotes alimentados en el crecimiento de la cepa EG92 de T. virens endofítico, por lo tanto, el peso de masa de MnO NP fabricado utilizando un sistema de fermentación sumergido a través del modo alimentado por lotes dentro de un biorreactor de 7 L. (FB1) alimentación constante para medio completo, (FB2) alimentación de pulsos exponenciales para medio completo, (FB3) alimentación constante para WBE y (FB4) alimentación de pulsos exponenciales para WBE.

Se emplea una técnica de optimización durante la biosíntesis de cualquier nanomaterial para encontrar las condiciones experimentales ideales para producir los mejores y más estables resultados. Los sistemas de optimización tradicionales ignoran las interacciones entre variables independientes, y ejecutar muchos experimentos lleva mucho tiempo y es costoso. En nuestro trabajo, el efecto de diferentes parámetros sobre la producción de biomasa y el rendimiento de MnO NP podría medirse mediante un diseño experimental estadístico (método de Taguchi) para encontrar las mejores condiciones utilizando matrices ortogonales y análisis de varianza. El diseño experimental de Taguchi, también conocido como diseño de parámetros robustos, puede comparar diferentes condiciones experimentales y seleccionar la que tiene la menor variabilidad como la más fuerte.

Así, el método de diseño de Taguchi es una herramienta de optimización estadística que proporciona resultados simples, eficientes y sistemáticos para maximizar la producción26,41. Para estudiar las variables más influyentes que optimizaron la producción de NPs de MnO usando extracto de hongos como agentes reductores/tapadores y MnCl2·4H2O como compuesto original (precursor), se planeó un diseño experimental Taguchi (TD) con 25 ensayos usando 6 factores en cinco niveles Luego se determinó el peso de la masa de MnO NP fabricado con hongos (respuesta del modelo) para calcular las relaciones S/N más grandes para cada prueba (Fig. 11G). En general, hay variaciones en los aumentos de peso de masa de MnO NP de 160,45 ± 1,99 g/l (Trail 5) a 315,3 ± 0,19 g/l (Trail 19), por lo que las variables probadas aumentan significativamente las cantidades de peso de MnO NP como se indica en ( Tabla 7).

Una evaluación estadística de la influencia de los factores significativos indicados, incluida la concentración de precursor de metal. (V1), agente reductor/capaz conc. (V2), temperatura (V3), pH (V4), agente estabilizante conc. (V5), y el tiempo de reacción (V6) sobre la producción biogénica de NPs de MnO se llevó a cabo utilizando el diseño experimental de Taguchi. (A) Gráfico de respuesta de la relación S/N para MnO NP fabricados con hongos, (B) Gráfico circular que muestra la distribución porcentual de cada factor.

La ecuación de regresión fue generada por la respuesta (variable dependiente) y los niveles codificados de las variables independientes (Cuadro 8). El coeficiente de determinación del modelo R2 = 0,9814, lo que indica que en este modelo se podría designar el 98,14% de la variabilidad de la respuesta, mientras que no se puede definir el 1,68% de la variación total. Una alta correlación (Adj. R2 = 0,9751) también indica el grado de precisión que confirmó la alta significancia del modelo. Dado que el modelo fue significativo porque el valor F fue superior al tabulado varias veces. Además, el nivel de confianza calculado (%) y los valores de p mostraron los rangos de cada variable, ya que las variables significativas tienen niveles de confianza de hasta el 95%. La Figura 11H muestra que la contribución de presencia más alta para diferentes variables se registró en el tiempo de reacción (66 %), seguido de la temperatura de reacción (17 %) y el pH de reacción (9 %). Por lo tanto, estas variables y su combinación se consideran importantes para aumentar el peso de la masa de las NP de MnO utilizando extracto endófito de la cepa EG92 de T. virens. Finalmente, la mejora de la reacción de NP de MnO fabricada con hongos se logró con MnCl2·4H2O como compuesto principal (0,25 M), extracto fúngico como agente reductor/de protección (100 %), pH de reacción ~ 5, temperatura de reacción (60 °C ), tiempo de reacción (5 h), y extracto fúngico como agente estabilizante (20%). Por lo tanto, el peso de masa máximo de MnO NP fabricado con hongos se incrementó hasta 40 veces (395,36 g / l) que el BC. Finalmente, este estudio se considera el primer estudio que fabricó NP de MnO industrialmente utilizando metabolitos bioactivos extraídos utilizando Trichoderma virens endofítico a través de estrategias de bioprocesamiento estadístico. Además, las NP de MnO fabricadas se prepararon biológicamente utilizando los metabolitos bioactivos extracelulares de la cepa endofítica EG92 como agente reductor/de protección y MnCl2·4H2O como compuesto original.

La Figura 12 muestra las estrategias de bioprocesamiento estadístico aplicadas para aumentar la producción del peso en masa de la cepa endofítica EG92 y el peso en masa de MnO NP fabricado con hongos. Estos experimentos se diseñaron para optimizar las condiciones de cultivo de la cepa endofítica EG92 utilizando diseños PB y BB. Estas células y, por lo tanto, las NP de MnO, se ampliaron a escala en un biorreactor semiindustrial que utiliza un sistema de fermentación sumergido en los modos BF y FBF. Dado que el sistema de cultivo BF se mejoró usando múltiples tasas de aireación/agitación, también se mejoró el modo FBF, usando varias estrategias de alimentación para todo el medio o WBE que usaba el modo exponencial o de pulsos. Además, la reacción de fabricación de MnO NP también fue optimizada por TD. Generalmente, estas estrategias estadísticas tienen una importante ventaja sobre los métodos convencionales. Los resultados finales indicaron que la masa de células secas y las producciones de MnO NP fabricadas con hongos aumentaron, como se muestra en la Fig. 12.

Resumen de las estrategias de bioprocesamiento que se aplicaron para optimizar el peso de masa (g/l) de la cepa EG92 de Trichoderma virens endófito, así como el peso de masa (g/l) de las NP de MnO fabricadas con hongos utilizando Plackett-Burman (PB), Box-Behnken (BB), y Taguchi (TD) diseños experimentales. Aumento de la producción de hongos en masa a través de un biorreactor semiindustrial (7 L) mediante un sistema de fermentación sumergido a través de modos de fermentación por lotes (BF) con alimentación por lotes (FBF) que se compararon finalmente con las condiciones basales (BC).

Hasta la fecha, ningún estudio ha analizado la biosíntesis de NP de MnO utilizando extracto endofítico de Trichoderma virens como agente reductor, protector y estabilizador, seguido de la optimización industrial de las variables operativas utilizando diversas metodologías experimentales estadísticas y luego aumentando la producción a través de lote alimentado. fermentación.

Se prepararon diferentes concentraciones de MnO NP fabricadas para evaluar sus actividades antagónicas y detectar MIC, MBC y MFC usando diferentes fitopatógenos. La Tabla 9 muestra el diámetro de las zonas de inhibición que se expresan en milímetros. En general, la CIM excelente para las NP de MnO micosintetizadas se registró frente a bacterias fitopatógenas a 210 µg/ml, sin embargo, frente a hongos fitopatógenos se verificó a 330 µg/ml. En el caso de los hongos fitopatógenos, los mayores halos de inhibición se registraron frente a Alternaria alterna (42,75 ± 3,96), seguido de Helminthosporium sp., (40,38 ± 2,58), sin embargo, el menor lo midió frente a Phytophthora arenaria con (28,13 ± 2,97). Sin embargo, frente a bacterias fitopatógenas, los mayores halos de inhibición se registraron frente a Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34), seguida de Acetobacter pasteurianus (47,81 ± 6,34) y Erwinia carotovora (42,18 ± 2,56). Los resultados más bajos se observaron contra Clavibacter michiganensis (33,75 ± 1,90) Erwinia persicina (39,37 ± 1,02). Además, los valores obtenidos de MBC oscilaron entre 200 y 280 µg/ml, y los valores de MFC se extendieron a 340–440 µg/ml. En general, las NP de MnO sintetizadas por mico tienen actividades antagónicas rápidas y más efectivas contra las bacterias fitopatógenas que los hongos en este estudio. Debido a que nuestras NP de MnO micosintetizadas tienen actividades antagónicas más rápidas y precisas contra las bacterias fitopatógenas que contra los hongos, pueden usarse como un nanobiopesticida alternativo en el futuro para controlar varias enfermedades y patógenos. Las NP de MnO tienen varias propiedades únicas, como la capacidad de penetrar rápidamente en las células patógenas al inducir distorsiones y destrucción de la membrana celular, lo que resulta en la muerte celular microbiana. Joshi et al. biosintetizaron MnO2 NP usando extracto de plantas (extracto de hojas de Datura stramonium como agente reductor), luego 10 mg/ml de MnONP se compararon con patógenos humanos y descubrieron que exhibían efectos antagónicos efectivos (30-44 mm)24. Para biosintetizar ZnO, MnO2 y MgO NP, Ogunyemi et al. emplearon bacterias rizosféricas (Paenibacillus polymyxa cepa Sx3). Sus estudios revelaron efectos inhibidores significativos (13–17 mm) a una concentración de 16,0 µg/ml contra bacterias fitopatógenas (Xanthomonas oryzaepv.oryzae)6. La aplicación a las plantas de arroz también mejora los factores de crecimiento y la biomasa de las plantas al tiempo que reduce la expresión de la enfermedad del tizón bacteriano de la hoja del arroz, según este estudio. Por lo tanto, estas nanopartículas metálicas no son tóxicas, son bioseguras y biocompatibles en dosis bajas. Finalmente, la aplicación de campo de MnO NP micosintetizados como pesticida potencial en la agricultura aún no se ha investigado a fondo hasta ahora.

En este estudio, se formaron NP de MnO micosintetizadas en forma de varilla sintetizadas biológicamente con un tamaño de cristalito promedio de ~ 35 nm utilizando MnCl2.4H2O (precursor) y extracto endófito de la cepa EG92 de Trichoderma virens (agentes reductores, estabilizantes y de protección) que cultivaron en salvado de trigo medio. Se utilizaron múltiples enfoques de optimización estadística (diseños de Placket-Burman y Box-Behnken) para lograr el mayor peso de masa de células fúngicas. Dado que el diseño de Placket-Burman se utilizó para detectar las principales influencias en la producción de biomasa fúngica. Las correlaciones entre los parámetros importantes y el peso de la biomasa fúngica producida se correlacionaron luego mediante un diseño factorial de Box-Behnken. Luego, los rendimientos de las células EG92 y las NP de MnO se impulsaron industrialmente mediante un modo de fermentación por lotes sumergido con tasas ajustables de aireación/agitación, seguido de un modo de fermentación por lotes alimentados mediante un sistema de alimentación de pulsos exponenciales. Después de 48 h, esta línea de producción industrial produjo Xmax (295,36 g/l) y Pmax (217,95 g/l). El rendimiento de MnO NP se incrementó 40 veces (395,36 g/l) por encima de las condiciones de referencia utilizando el diseño de Taguchi para mejorar la reacción de fabricación. Estos resultados son únicos en el sentido de que maximizan la producción de biomasa endofítica de Trichoderma y, como resultado, la biosíntesis de MnO NP utilizando material de desecho, algo que nunca antes se había hecho. Este nivel de biomasa de peso seco y productividad de rendimiento de MnO NP nunca se había visto antes. Se investigó la actividad antagónica frente a fitopatógenos, y Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34) presentó los mayores halos de inhibición, seguida de Alternaria alterna (42,75 ± 3,96). Además, los valores de MBC para células bacterianas variaron de 200 a 280 µg/ml, mientras que los valores de MFC para células de hongos fitopatógenos variaron de 340 a 440 µg/ml. Finalmente, estas NP de MnO micosintetizadas no son tóxicas, son bioseguras y biocompatibles en dosis bajas. Como resultado, podría emplearse como nanobiopesticida en la agricultura.

Se recolectaron hojas sanas de berenjena negra egipcia (Solanum melongena L.) de la granja experimental de la Ciudad de Investigación Científica y Aplicaciones Tecnológicas (SRTA-City), Ciudad de New Borg El-Arab, Alejandría, Egipto. Se recolectaron los hongos fitopatógenos probados (Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Helminthosporium sp., Alternaria alternativa, Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Phytophthora arenaria) y bacterias (Clavibacter michiganensis, Erwinia carotovora, Acetobacter pasteurianus, Erwinia amylovora y Erwinia persicina). del Departamento de Desarrollo de Bioprocesos, GEBRI, SRTA-City, Egipto y la Universidad de Zagazig, Facultad de Agricultura, El-Sharkia, Egipto.

Las hojas de las plantas se lavaron con agua del grifo tres veces, luego se sumergieron sucesivamente en etanol al 70 % durante 5 min, etanol al 99 % durante 2 min y finalmente las hojas se empaparon en una solución de esterilización al 6 % compuesta por (NaHCO3 al 10 %: Tween al 0,1 % -20) durante 2 min. Las hojas esterilizadas se lavaron varias veces con agua destilada esterilizada y se dejaron secar en una cabina de flujo laminar33. El agua de enjuague final se esparció sobre placas de agar papa dextrosa (PDA) que contenían 200 g de papas, 20 g de dextrosa y 20 g de agar para probar el paso de esterilización. Estas hojas esterilizadas se cortaron y trituraron con una hoja de bisturí estéril y se trituraron en un mortero. Utilizando el método de dilución en serie, se prepararon 100 µl del extracto de hojas diluidas y se esparcieron en placas de PDA y se incubaron a 30 °C durante tres semanas. Los hongos entófitos se seleccionaron y purificaron utilizando placas de PDA. Finalmente, los hongos entófitos purificados se cultivaron utilizando un caldo MGYP compuesto por 0,3 % de extracto de malta, 1 % de glucosa, 0,3 % de extracto de levadura, 0,5 % de peptona y el pH final se ajustó a 5,9. Luego estos cultivos se incubaron a 30 °C en condiciones de agitación (150 rpm) durante 72 h.

Las NP de MnO se biosintetizaron utilizando MnCl2·4H2O como compuesto principal (precursor) y el extracto fúngico como agentes reductores, estabilizantes y protectores. Las NP de MnO se sintetizaron mezclando 100 ml de un extracto fúngico con 100 ml de MnCl2.4H2O 1 M, y posteriormente se agitó continuamente a 60 °C durante 2 h (Incubación 1). El color de la reacción cambia de amarillo a marrón amarillento debido a la reducción del ion Mn. Se añadió la cantidad en exceso de extracto fúngico (50 ml) a las NP de MnO producidas y se incubó en condiciones de agitación (200 rpm) a temperatura ambiente (28 °C) durante 5 h (Incubación 2). Luego, el color de la reacción cambia de marrón amarillento a marrón rojizo debido a la fase de cobertura (que puede reconocerse fácilmente a simple vista)6,27. Finalmente, las NP de MnO sintetizadas por hongos se centrifugaron a 10 000 rpm durante 20 min y se lavaron tres veces con agua destilada y etanol. Luego, el residuo marrón se secó en una estufa a 50 °C durante 24 h. Se usaron un mortero y una maja para triturar las NP de MnO hasta obtener un polvo fino estimado (g/l) y se almacenaron en viales tapados. Mediante el método de difusión de pozos, hongos y bacterias fitopatógenas estimaron la actividad antifitopatógena de las NP de MnO biosintetizadas.

Los espectros de absorción UV-Visible de MnO NP fabricados con hongos se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-Vis (Shimadzu, Tokio, Japón). El análisis de espectros FTIR para la fracción extracelular fúngica y las NP de MnO fabricadas con hongos se registraron en (Shimadzu FTIR-8400 S, Japón), en el rango espectral de 4000–400 cm−1. SEM: la estructura morfológica de las NP de MnO se detectó mediante una investigación con microscopio electrónico de barrido (SEM) utilizando un (JEOL JSM 6360LA, Japón) con su unidad combinada EDX. La estabilidad térmica de las NP de MnO fabricadas con hongos se determinó utilizando el modelo de análisis termogravimétrico (TGA) (TGA/DSC, Shimadzu, Japón), con una velocidad de calentamiento de 20 °C/min bajo flujo de nitrógeno. Los patrones de difracción de rayos X (XRD) se obtuvieron utilizando (difractómetro Shimadzu 7000, Japón), operando con radiación CuKα (λ = 0,15406 nm) generada a 30 kV y 30 mA con una velocidad de barrido de 2°/min para valores de 2θ entre 20 y 80 °C. El tamaño de cristal promedio se estimó usando la fórmula de Scherrer como se muestra en la ecuación. (1); Donde Y es el tamaño del cristal de MnO NP fabricado con hongos, λ es una longitud de onda de la radiación CuKα, β es la mitad del máximo de ancho completo del pico diferente y θ es la mitad del ángulo de difracción.

Entre los cinco hongos endófitos aislados, se eligió un aislado para investigaciones adicionales con alta frecuencia de producción de NP de MnO fabricadas por hongos, que tienen actividades antifitopatogénicas competentes. Para determinar el espaciador transcrito interno ribosomal (ITS), el genoma del hongo se extrajo y se purificó utilizando el kit de ADN Minipreps que se obtuvo de (Promega, EE. UU.). La región ITS se amplificó mediante PCR con 10 pmol del cebador ITS1 (5′-CTGGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) y 10 pmol del cebador ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′). Esta reacción se preparó mezclando 100 mg de ADN fúngico, cada uno de dNTP 2,5 mM y MgCl2 1,5 mM, con 0,4 μl de 500 U Taq ADN polimerasa42. La temperatura inicial de desnaturalización fue de 95 °C y se extendió a 5 min, y la extensión final se extendió a 10 min a 72 °C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis y se visualizaron utilizando un transiluminador UV. De acuerdo con la migración electroforética, los productos de PCR interesados ​​se eluyeron del gel usando columnas giratorias de sílice (DNA Clean & Concentrator, Zymo Research). El producto de PCR purificado se secuenció directamente de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (secuenciador de ADN automatizado modelo 3130, analizador genético, Applied Biosystems, Hitachi, Japón). La secuencia se comparó con las secuencias homólogas usando NCBI BLAST disponible en http://www.ncbinlmnih.gov/. El alineamiento de secuencias múltiples se llevó a cabo usando el software BioEdit (Hall, 1999), y se construyó un árbol filogenético usando el método de unión de vecinos (NJ) a través de un programa MEGA6.

Los metabolitos bioactivos extraídos se utilizaron como agentes reductores, protectores y estabilizadores en la fabricación de NP de MnO. Por lo tanto, se extrajeron fracciones extracelulares y citoplasmáticas para detectar el compartimento celular fúngico competente que produjo las cantidades más altas de MnO NP. También se estudió la estrategia de evaluación comparativa para medios de cultivo de hongos que produjeron el máximo de metabolitos. Primero, el medio de crecimiento utilizado se eligió como se informó en otro lugar 43,44,45 como se muestra en la (Tabla 1S, Materiales complementarios). Todos los medios analizados (50 ml) se prepararon en matraces de 250 ml y se autoclavaron por separado durante 15 min a 121 °C. En el caso del medio de salvado de trigo (WBM), el extracto de salvado de trigo (WBE) se preparó mezclando 10 g de salvado de trigo secado al horno con 90 ml de agua destilada a 60 °C durante 5 h, luego se incubó a 100 °C durante 1 hora Posteriormente, los nutrientes extraídos fueron separados por un sistema de filtración a pH ajustable 7.046. Este filtrado se completó hasta un volumen total de 100 ml con agua destilada y se autoclavó por separado durante 15 min a 121 °C. Todos los medios esterilizados se inocularon con inóculos fúngicos (5 %, v/v) y se cultivaron a 28 °C durante 48 h (150 rpm). Un sistema de ultrafiltración recogió la biomasa fúngica para preparar la fracción extracelular. La fracción citoplasmática se extrajo suspendiendo la biomasa fúngica recolectada en PBS 50 mM (pH 7,0), luego se sonicó al 40–50 % durante 25–30 ráfagas. Finalmente, las fracciones obtenidas se centrifugaron durante 20 min a 10.000 rpm y luego se almacenaron en botellas de vidrio limpias a rosca a 4 °C. Los contenidos totales de proteínas y carbohidratos de todas las fracciones se determinaron usando un kit de ensayos colorimétricos de proteínas Commercial-Rad y un kit de ensayos colorimétricos de carbohidratos (Milpitas, CA 95035 EE. UU.). Los análisis fitoquímicos (contenidos de alcaloides, flavonoides, taninos, fenoles, esteroides, saponinas y terpenoides) fueron detectados en estudios comparativos para determinar la fracción celular competente que actuó como agente reductor, taponador y estabilizador21. Finalmente, la fabricación de las reacciones de MnO NP se configuró como se describió anteriormente para usar su peso seco en los estudios comparativos.

La estrategia de bioprocesamiento utilizada se inició con el desarrollo de condiciones efectivas para la extracción de nutrientes solubles del polvo de salvado de trigo. Dado que el método de extracción afectó las cantidades de carbohidratos, proteínas, aminoácidos y otros elementos traza extraídos del salvado de trigo. Entonces, hay muchos factores como el polvo de salvado de trigo (50, 100 y 150 g/l), el tiempo de extracción (3, 12 y 24 h), el pH (6, 7 y 8) y la temperatura de extracción (30, 12 y 24 h). 50 y 70 °C), se estudiaron en estos experimentos. En segundo lugar, se optimizaron todos los ingredientes del medio y las condiciones de crecimiento de hongos que afectaron la producción de biomasa. En consecuencia, se aplicaron enfoques de optimización estadística sucesivos (diseños de Plackett-Burman y Box-Behnken) para producir el mayor peso de masa de células fúngicas. Dado que se empleó el diseño de Plackett-Burman para evaluar los factores significativos que afectan la producción de biomasa fúngica. Posteriormente, se aplicó el diseño factorial de Box-Behnken para correlacionar las relaciones entre los factores significativos y el peso de la biomasa fúngica producida.

Este diseño experimental se empleó para optimizar la producción de biomasa fúngica investigando el efecto de diferentes variables de cultivo. Para este estudio, la matriz utilizada consistió en 12 experimentos (trails) y 9 variables independientes (edad de los inóculos, agitación, pH, CuSO4, temperatura de incubación, WBE (%), glucosa, tamaño de los inóculos y MgSO4), cada una de las cuales tiene un nivel bajo (−) y nivel alto (+). Todos los ensayos se realizaron por triplicado para detectar las variables significativas y se calcularon los valores medios de producción de biomasa fúngica (respuesta). Los datos finales se analizaron estadísticamente para determinar el valor de p y los niveles de confianza utilizando análisis de regresión estándar. Posteriormente, se aplicó la ecuación del modelo polinomial de primer orden (Ec. 2) mediante una prueba F, donde Y es la respuesta, βo es el intercepto del modelo, βi es la estimación de la variable y Xi es la variable37,47. Además, el efecto de cada factor se determinó utilizando la ecuación. (3); donde E(x) es la producción de biomasa fúngica, N es el número de senderos, M+ y M- son el efecto de este factor en sus niveles.

Un diseño de tres niveles es un poderoso método estadístico utilizado para optimizar el proceso de fermentación microbiana al examinar la interacción de factores importantes en la producción de biomasa. Los tres parámetros independientes elegidos (pH, WBE y tamaño del inóculo) se probaron en tres niveles, codificados -, 0, + para valores bajos, medios y altos, respectivamente, para calcular y estimar el punto ideal para la producción máxima de biomasa. La variable de respuesta se ajustó a través de un modelo polinomial de segundo orden (Ec. 4) para correlacionar la respuesta dependiente con las variables independientes utilizando el software Minitab 18.1. La calidad del ajuste de la ecuación del modelo polinómico se expresó mediante el coeficiente de R239,40. Los valores reales de cada factor se determinaron usando la ecuación de Myers y Montgomery (Ec. 5); donde, Y es la respuesta pronosticada, βo es la intersección, βi es el coeficiente lineal, βij es el coeficiente cuadrático, βii es la interacción lineal por lineal entre Xi y Xj son los coeficientes de regresión, y XiXj son las variables de entrada que influyen en la variable de respuesta Y37.

La cepa fúngica probada se inoculó primero en placas de agar papa dextrosa y se incubó a 30 °C en condiciones estáticas durante 14 días. Luego, la suspensión de esporas se preparó mediante una solución salina estéril (0,9%) en condiciones asépticas. Estas esporas fúngicas se contaron mediante un hemocitómetro para preparar una suspensión de esporas adecuada para el paso de inoculación. El cultivo secundario se preparó mediante la inoculación de 500 ml de medio estadísticamente optimizado en botellas agitadas (1000 ml) con 0,5 ml de suspensión de esporas fúngicas recién preparada (3 × 104 esporas/ml) y se incubó a 30 °C. Finalmente, se inoculó un biorreactor BioFlo 310 de 7 L (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE. UU.), que contenía 4.5 L del medio estéril, luego se controló la temperatura y el pH a 30 °C y 5.5, respectivamente. La característica de mezcla de las tasas de aireación/agitación y el tiempo se estudiaron usando biomasa fúngica y producción de NP de MnO como respuestas a través de siete estrategias de control en el modo de fermentación por lotes. Las estrategias probadas se diseñaron como se describe en la Tabla 10. Durante los períodos de fermentación, se tomaron muestras para calcular la producción de biomasa y NPs de MnO.

El punto final del período de fermentación se detectó aumentando la concentración de oxígeno disuelto (OD), lo que indica el agotamiento de la fuente de carbono48,49. Entonces, en este punto, las cuatro estrategias de alimentación se probaron utilizando diferentes modos de fermentación por lotes. Las cuatro estrategias de alimentación por lotes probadas se establecieron con ingredientes medios optimizados completos o WBE solo como se describe en la Tabla 11. La tasa de flujo de aire y la velocidad de agitación se controlaron para permitir que el nivel de OD no fuera inferior al 10 % en todos los modos de fermentación de alimentación por lotes probados. En la fase logarítmica, la masa de células fúngicas aumenta exponencialmente con el tiempo. Mientras que el comportamiento del crecimiento fúngico y las NP de MnO producidas se describieron y determinaron cinéticamente a través de diferentes modelos de fermentación usando diferentes ecuaciones30,32. El coeficiente de rendimiento se determinó por la fuente de carbono consumida y la biomasa producida. Por lo tanto, se calcularon muchos parámetros, como el coeficiente de rendimiento de biomasa (YX/S), la biomasa máxima (Xmax), el rendimiento máximo de NP de MnO (Pmax) y la tasa de crecimiento específica máxima (µmax).

La reacción de biosíntesis de las NP de MnO se vio afectada por diferentes ingredientes y condiciones de reacción, como la concentración del precursor (metal principal), la concentración del extracto fúngico (agentes reductores/de protección), el pH, la temperatura de incubación, el tiempo de incubación (tiempo de reacción) y el agente estabilizador (extracto fúngico). ). El diseño de Taguchi se aplicó para maximizar la producción de MnO NP a través de los pasos de fabricación biológica competentes de esta estrategia de optimización. Entonces, en estos experimentos, se seleccionó el diseño de matriz ortogonal L25 Taguchi (5**6) para realizar esta estrategia de optimización, mientras que se utilizó el software MINITAB 18 y las ecuaciones. (6–9), donde se determinó el peso másico de las NP de MnO fabricadas con hongos y se calcularon las proporciones máximas de señal a ruido (S/N) para cada reacción de fabricación41. Finalmente, se realizó la prueba de validación en base a los resultados de Taguchi y se calcularon las relaciones S/N predichas.

Se registró y calculó la concentración inhibitoria mínima (MIC) de MnO NP fabricados con hongos. Además, las actividades antagónicas de las NP de MnO fabricadas con hongos contra los fitopatógenos (bacterias y hongos) se observaron y determinaron a través de un método de difusión23. Dado que los hongos fitopatógenos fueron cultivados en medio Czapek, éste contenía (g/l): NaNO3, 3,0; K2HPO4, 1,0; MgSO4∙7H2O, 0,5; KCl, 0,5; FeSO4∙7H2O, 0,01; y agar, 15 (pH 4,8). Además, se inocularon bacterias fitopatógenas en medio agar nutritivo compuesto por (g/l): [peptona 5, cloruro de sodio 5, extracto de carne 1,5, extracto de levadura 1,5 y agar 15 (pH 7,0)]. Se prepararon y cargaron en pocillos (0,5 mm) diferentes concentraciones de NP de MnO fabricadas con hongos (10, 50, 90, 130, 170, 210, 250, 290, 330 y 370 µg/ml). Luego, estas placas se incubaron a 30 °C durante 24 a 72 h y se examinaron en busca de zonas de inhibición. Finalmente, se verificaron y determinaron la concentración máxima bactericida (MBC) y la concentración máxima fungicida (MFC)50. Estos experimentos se realizaron por triplicado y estos datos se analizaron estadísticamente a través del ANOVA unidireccional utilizando el software Minitab.

El artículo incluye los datos utilizados para respaldar los resultados de un estudio. Los autores aclaran que no fueron necesarias más aprobaciones para realizar investigaciones sobre material vegetal, de acuerdo con las directrices locales e institucionales. Este aislado se envió a la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF429775) como cepa endofítica de Trichoderma virens EG92 con el número de acceso MF429775 porque era completamente similar a Trichoderma virens.

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ES Yahia y HY Zahran

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SHE propuso la idea y el concepto de investigación, ideó un plan de investigación, llevó a cabo la mayoría de los experimentos, recopiló datos, analizó, escribió/editó el original y revisó el manuscrito. ISY: Análisis y consulta de datos. HYZ: análisis de datos, consulta, revisión del manuscrito final; y EAK: análisis de datos, interpretación de datos y redacción/edición del manuscrito original y final. El manuscrito final fue escrito, revisado y aprobado por todos los autores.

Correspondencia a Shahira H. EL-Moslamy o Elbadawy A. Kamoun.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Recibido: 16 mayo 2022

Aceptado: 24 de enero de 2023

Publicado: 04 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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