Cambios atípicos en células de Candida albicans tratadas con Venetin

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2844 (2023) Citar este artículo

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En la presente investigación se caracterizó el efecto de un complejo proteína-polisacárido Venetin-1 obtenido del fluido celómico de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta sobre células de Candida albicans. El compuesto destruyó las células fúngicas sin mostrar citotoxicidad para los fibroblastos de la piel humana, lo que se demostró en estudios anteriores. Dado que tenía un efecto sobre la pared y la membrana celular fúngica, este complejo se comparó con el conocido antibiótico antifúngico fluconazol. Ambas preparaciones perturbaron la división de las células de levadura y dieron como resultado la formación de agregados y cadenas de células no separadas, lo que se ilustró mediante tinción con fluorocromos. La tinción fluorescente de la pared celular con blanco de Calcofluor facilitó la comparación de los tipos de agregados formados tras la acción de ambas sustancias. El análisis realizado con el uso de rojo Congo mostró que Venetin-1 expuso capas más profundas de la pared celular, mientras que dicho efecto no fue visible después del uso de fluconazol. El análisis FTIR confirmó cambios en la capa de manoproteínas de la pared celular tras la aplicación del complejo Venetin-1. La tinción con rodamina 123 y el uso de citometría de flujo permitieron comparar los cambios en las mitocondrias. Se observaron mitocondrias significativamente alargadas después de la aplicación de Venetin-1, pero no después de la aplicación del antibiótico clásico. La microscopía de contraste de fase reveló agrandamiento de la vacuola después de la aplicación de Venetin-1. El análisis de citometría de flujo de células de C. albicans tratadas con Venetin-1 y fluconazol mostró que ambas sustancias provocaban una disminución significativa de la viabilidad celular.

Los avances médicos se han acelerado considerablemente en los últimos años tanto en la cirugía como en el tratamiento de enfermedades crónicas e infecciones. Así, ha aumentado el número de pacientes con inmunidad debilitada como consecuencia del tratamiento quirúrgico, la antibioticoterapia, la quimioterapia o el tratamiento en unidades de cuidados intensivos (UCI) hospitalarias1,2,3,4. El lado oscuro de esta situación es el creciente número de infecciones nosocomiales. Son causados, entre otras cosas, por el uso excesivo de antibióticos, lo que conduce al desarrollo de resistencia microbiana a los medicamentos de uso común5. Las infecciones con patógenos nosocomiales prolongan la estancia del paciente en un centro médico y aumentan los costos del tratamiento2,3,6.

Los hongos Candida, especialmente Candida albicans, son un ejemplo de patógenos que causan este tipo de infecciones. C. albicans es un patógeno oportunista que vive como comensal en la superficie de la piel y las membranas mucosas y como parte de la microflora intestinal en sujetos sanos7,8,9. En pacientes inmunocomprometidos, este hongo provoca infecciones de la piel y las mucosas, así como candidiasis sistémicas potencialmente mortales e infecciones sistémicas7,10,11. Esta levadura es el cuarto patógeno de UCI más común en los EE. UU. y el primero en Europa3,4. Las infecciones sanguíneas por Candida asociadas con los ingresos en la UCI representan aproximadamente el 40 % de los casos, y el 9,3 % de los pacientes desarrollan sepsis2.

C. albicans debe su éxito como patógeno a la alta plasticidad del genoma, la capacidad de crear biopelículas, la producción de enzimas líticas y la capacidad de adherirse a las superficies7,9,11,12,13. Las biopelículas son particularmente peligrosas para los pacientes. Se pueden formar tanto en superficies naturales como artificiales. Los biofilms son resistentes a altas concentraciones de antibióticos antifúngicos, lo que dificulta su eliminación, y son una fuente de células patógenas que pueden crear nuevos focos de infección en el organismo7,14,15. Se estima que la tasa de mortalidad en sujetos infectados con Candida puede llegar al 40%2,3,16,17.

El fluconazol es uno de los antibióticos más utilizados en el tratamiento de la candidiasis. Es un antibiótico azólico que actúa inhibiendo la enzima 14-α-esterol desmetilasa implicada en la síntesis de esteroles de membrana7. Esto da como resultado un cambio en las propiedades y la estructura de la membrana celular, lo que conduce a la inhibición del crecimiento del hongo. A pesar de la baja toxicidad del fluconazol para las células huésped, se informa cada vez más que el fármaco es ineficaz en el tratamiento de la candidiasis7. Esto es causado por el desarrollo de resistencia a los antibióticos por parte de los microorganismos a través de mutaciones en su material genético que conducen a un aumento en el número de bombas multifármaco en la superficie de sus células7,18.

Debido a la tendencia de C. albicans a desarrollar resistencia a los antibióticos, es necesario buscar preparados alternativos que puedan ser utilizados en el tratamiento de la candidiasis. El entorno natural, que ha inspirado la medicina natural durante cientos de años, puede utilizarse como fuente de dichas sustancias. Las lombrices de tierra son organismos que se han utilizado durante mucho tiempo para tratar infecciones fúngicas en la medicina tradicional del Lejano Oriente. También se han utilizado para tratar muchas otras enfermedades, como la ictericia o las enfermedades cardiovasculares, y para aumentar la inmunidad19,20. Pastas, polvos y extractos preparados a partir de lombrices de tierra y sus simbiontes tienen actividad documentada contra levaduras y bacterias Candida20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. El líquido celómico de lombriz, las fracciones separadas del líquido y los extractos de estos invertebrados muestran también actividad anticoagulante, antiinflamatoria y antitumoral19,32,33.

Nuestros estudios mostraron que el complejo proteína-polisacárido descrito previamente como una fracción del líquido celómico no tenía actividad citotóxica contra los fibroblastos humanos normales34. El complejo Venetin-1 mostró actividad antitumoral contra el cáncer de pulmón no pequeño35 y el cáncer de colon36 y ejerció un efecto antiagregante plaquetario multivía sin coagulopatía ni citotoxicidad37. El compuesto activo se separó del fluido celómico de la lombriz de tierra después de eliminar su citotoxicidad usando incubación a temperatura elevada33. Después de este proceso, se mantuvo la actividad antitumoral y antifúngica, y al mismo tiempo se preservaron las células normales. En términos químicos, la preparación tenía la misma composición en cada punto analizado y se caracterizó químicamente en publicaciones anteriores como un compuesto de proteína-polisacárido y una micropartícula con dimensiones de 58,23 ± 3,93 nm34,35.

Dado que el complejo obtenido actúa sobre la pared celular y la membrana de C. albicans, como se muestra en publicaciones anteriores, parecía conveniente analizar este efecto en comparación con el antibiótico estándar, que también interactúa con la membrana celular del hongo. Dada la creciente resistencia a los antibióticos de los microorganismos, los resultados de los estudios sobre la actividad antifúngica del complejo sugieren que el complejo del líquido celómico puede ser una preparación valiosa en la lucha contra las enfermedades causadas por hongos del género Candida.

En esta investigación se utilizaron lombrices de tierra Dendrobaena veneta. Estos invertebrados fueron criados en condiciones supervisadas en el Departamento de Inmunobiología de la Universidad Maria Curie-Skłodowska en Lublin (Polonia). Los anélidos se mantuvieron en recipientes con una capacidad de 3L. Los contenedores se llenaron con suelo de compost y se mantuvieron en la oscuridad con flujo de aire a 25 °C y 70–80 % de humedad. Las lombrices fueron alimentadas tres veces por semana con hojas de té verde, celulosa y verduras hervidas. Solo se seleccionaron lombrices maduras para los experimentos.

Las lombrices de tierra enjuagadas con agua se mantuvieron en lignina húmeda durante 24 h. El fluido celómico (FC) se obtuvo de grupos de 10 individuos sumergidos en una pequeña cantidad de NaCl al 0,9% para mantener la conductividad eléctrica. El fluido se obtuvo tras electroestimulación con una corriente de 4,5 V aplicada durante 1 min. El FC obtenido se centrifugó (6000 xg, 10 min) para separar los celomocitos. Luego, el sobrenadante se filtró a través de filtros Millipore de 0,22 y se calentó a 70 °C durante 10 min. Luego, el CF libre de células se transfirió a una bolsa de diálisis con un límite de 12–14 kDa y se dializó durante la noche a 4 °C frente a agua destilada. El complejo estéril se transfirió a tubos Eppendorf, se liofilizó y se almacenó a -20 °C. La concentración de proteína en el complejo Venetina-1 se determinó con el método de Bradford38.

El aislado clínico de la cepa de tipo salvaje de C. albicans utilizada para el análisis microbiológico fue donado por el Prof. A. Kędzia del Departamento de Microbiología Oral de la Universidad Médica de Gdańsk. Antes de los experimentos, el cultivo fúngico se sembró previamente en medio líquido Sabouraud a 28 °C. Después de 24 h de incubación, se añadieron 30 µL del cultivo de C. albicans (107 UFC en fase de crecimiento logarítmico) a 150 µL de medio pobre en YPD suplementado con sulfato de estreptomicina (Sigma) a una concentración final de 0,17 mg mL−1 y Venetin-1 o fluconazol. Las concentraciones finales de Venetin-1 y fluconazol utilizadas en los experimentos fueron 25, 50 y 100 µg mL−1 y 5, 10 y 20 µg mL−1, respectivamente. Las muestras se incubaron a 37 °C durante 48 h con agitación.

Los cultivos celulares destinados al análisis microscópico se prepararon como se describe en la sección "Preparación del cultivo celular de C. albicans con Venetina-1 y fluconazol" de Materiales y métodos. Los análisis de microscopía de luz de contraste de fase se realizaron utilizando células de C. albicans sin teñir. Se utilizaron cuatro fluorocromos: rojo Congo, blanco Calcofluor, Hoechst 33342 con mezcla de yoduro de propidio y rodamina 123 para microscopía de fluorescencia. El análisis de microscopía de fluorescencia y el análisis de contraste de fase se realizaron con el uso de un microscopio de barrido láser confocal (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Todas las longitudes de onda de excitación utilizadas en el análisis y las estructuras visualizadas se presentan en la Tabla 1.

Calcofluor white (Fluka) se une a la quitina en la pared celular fúngica. El fluorocromo (solución acuosa al 20 %) se incubó con una suspensión 1:1 de las células analizadas durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, se transfirieron 2 µL de la suspensión a un portaobjetos de microscopio y se observaron. Los agregados presentes en todos los cultivos se contaron después del análisis de 1000 formularios. El experimento se repitió tres veces. Las formas identificadas fueron células individuales, dobletes, tripletes, cuatrillizos, cadenas, agregados pequeños (< 10 células), agregados grandes (> 10 células) e hifas/pseudohifas.

Se utilizó colorante rojo congo (Sigma-Aldrich) para visualizar los β-1,4 glucanos 1,- de la pared celular. La solución acuosa (2%) del colorante se mezcló con la suspensión de células de C. albicans analizadas en una proporción de 1:1. Después de 3 min de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, se transfirieron 2 µL de la preparación a un portaobjetos y se observaron.

Se preparó una mezcla de tinción con Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) y yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) y se añadió a los cultivos fúngicos en una proporción de 1:1 y luego se incubó a 37 °C durante 5 min en la oscuridad. Se analizaron 2 µL de la suspensión celular bajo el microscopio. Los colorantes se utilizaron para la visualización del material genético de las células en su estado actual: las células regulares mostraron una fluorescencia azul de los núcleos, las células apoptóticas exhibieron una fluorescencia blanca brillante de material genético fragmentado y las células necróticas mostraron una fluorescencia roja39,40.

El colorante Rhodamine 123 (ThermoFisher Scientific) se utiliza para teñir las membranas de las mitocondrias que funcionan correctamente. Las mitocondrias activas exhiben fluorescencia verde. Las células con funcionamiento alterado de las mitocondrias no tienen potencial de membrana y no emiten fluorescencia. Se utilizó rodamina 123 en dos concentraciones: 120 µg mL−1 para las células control y cultivos incubados con Venetin-1 y 30 µg mL−1 para las células tratadas con fluconazol. El uso de la dosis más baja del colorante para fluconazol se relacionó con el aumento de la permeabilidad de la pared celular de C. albicans después del tratamiento con antibióticos. El control negativo se realizó con azida de sodio, que es un inhibidor de la vía de respiración mitocondrial41. Una solución de azida de sodio al 1,3% (Sigma) se incubó con las células de control en una proporción de 1:1 durante 10 min a temperatura ambiente. Todas las células fúngicas, es decir, el control positivo y negativo y las células tratadas con fluconazol y Venetin-1, se incubaron con Rodamina 123 a diferentes concentraciones a 37 °C durante 20 min y luego se lavaron 3 veces con agua estéril. Las muestras se transfirieron a portaobjetos de microscopio y se observaron.

Las células del cultivo de control y las células tratadas con Venetin-1 a la concentración de 100 µg mL−1 se centrifugaron (temperatura ambiente, 6000xg, 10 min) y se descartó el sobrenadante. El sedimento se suspendió en 200 µL de una solución de GH (compuesta por glucosa, HEPES y agua estéril) y se centrifugó nuevamente. Luego, se eliminó el sobrenadante y se agregaron 20 µL de la solución de GH. A continuación, las células se transfirieron a una cámara de sublimación con una temperatura de -92 °C durante 12 min. Posteriormente, los cultivos congelados se cortaron en la cámara de preparación y se analizaron con un microscopio de emisión de campo ZEISS Ultra Plus (Carl Zeiss, Alemania) con alta tensión electrónica (EHT) de 5 kV y con un aumento de 30.000 × 39,42.

Los cultivos celulares preparados como se describe en la sección "Preparación del cultivo celular de C. albicans con Venetin-1 y fluconazol" de Materiales y métodos se centrifugaron a temperatura ambiente a 2500 xg durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se suspendió en 70 µL de una solución fijadora (10 ml de tampón fosfato pH = 7, 10 ml de glutaraldehído al 10 %, 200 mg de sacarosa) y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, se descartó la solución fijadora y se agregó tampón fosfato 0,1 M pH = 7. Después de la centrifugación (2500 x g, 30 min, temperatura ambiente), se añadió una solución de OsO4 al 1,5 % y se incubó con las células durante 30 min a temperatura ambiente. Después de eso, las células fúngicas se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Luego, los cultivos se lavaron con tampón fosfato y se centrifugaron. Las células así preparadas se deshidrataron en una serie de diluciones de acetona (15%, 30%, 50%, 70%, 100%), se transfirieron a platinas SEM con discos de carbón y se secaron en un desecador durante 24 h en presencia de de gel de silicona tostado (durante 2 h a 180 °C). Posteriormente, las etapas con las sondas se recubrieron con una capa de oro utilizando una máquina de pulverización catódica K550X (Quorum Technologies, Reino Unido) y se observaron con el uso de un microscopio electrónico de barrido Tescan Vega 3 (Tescan Orsay Holding, República Checa)39.

El análisis de citometría de flujo utilizado en nuestra investigación permitió la discriminación entre células vivas, apoptóticas y muertas. Los cultivos celulares se prepararon para el análisis como se describe en la sección "Preparación del cultivo celular de C. albicans con Venetin-1 y fluconazol" de Materiales y métodos. A continuación, se añadieron 20 µL de la suspensión del cultivo celular a 780 µL del reactivo ViaCount (Luminex, EE. UU.) y se incubó durante 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los canales de registro de emisiones utilizados para ViaCount fueron rojo y amarillo. Se contaron 5000 células para cada muestra. Los resultados se analizaron con el software GuavaSoft con la denominación Via count y se contó la viabilidad con la herramienta EasyFit, que permite distinguir células viables y apoptóticas superpuestas entre sí. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro de flujo Guava easyCyte (Luminex, EE. UU.).

El análisis de citometría de flujo de mitocondrias activas en células de C. albicans se realizó con el uso de Rodamina 123 (solución de agua 20 µg mL−1). La suspensión celular preparada como se describe en la sección "Preparación del cultivo celular de C. albicans con Venetin-1 y fluconazol" de Materiales y métodos se mezcló con una solución de fluorocromo y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min41. Los canales utilizados para el registro de emisiones fueron Forward Scatter y Green. Los resultados se analizaron utilizando el programa InCyte. El análisis de significación estadística se realizó utilizando el programa Statistica y la prueba HSD Tuckey.

La espectroscopia FTIR es una de las técnicas de investigación más utilizadas para la observación de la estructura química de compuestos orgánicos e inorgánicos. También es ampliamente utilizado en estudios de sistemas biológicos. La principal ventaja de la técnica FTIR en comparación con otros métodos espectroscópicos es el hecho de que casi todos los compuestos químicos muestran una absorción característica de la radiación en la región espectral IR; por lo tanto, pueden analizarse tanto cualitativa como cuantitativamente43. La espectroscopia infrarroja examina la absorción de radiación asociada a la excitación de los niveles vibracionales de las moléculas, lo que facilita la observación de cambios en la zona de los enlaces químicos. Para observar los cambios que se producen en las células de C. albicans tras el tratamiento con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL−1 y fluconazol a una concentración de 20 µg mL−1, se obtuvieron espectros FTIR de las muestras preparadas. . Los ensayos se realizaron mediante la técnica ATR directamente de la superficie de la muestra a temperatura ambiente. El espectrómetro se registró usando un espectrómetro Thermo Nicolet 8700 FTIR con un accesorio ATR de diamante Smart Orbit™ equipado con un detector DTGS (sulfato de triglicina deuterado). Los espectros se registraron en el rango infrarrojo medio: 4000–650 cm−1 con una resolución espectral de 4 cm−1. Los espectros obtenidos se sometieron a corrección de línea base y normalización escalada.

La tinción con blanco de Calcofluor que dio como resultado una intensa luminosidad de la pared celular distinguió diferentes agregados en el cultivo de células de C. albicans (Fig. 1). Las células de C. albicans se incubaron con Venetin-1 y fluconazol a diferentes concentraciones; posteriormente, se contaron los agregados individuales y su porcentaje se muestra en la Fig. 2. El número de células individuales disminuyó del 43,72 % en el cultivo de control al 17,61 % en el cultivo incubado con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL−1 y al 10,79% en el cultivo tratado con fluconazol a una concentración de 10 µg mL−1. Se observó el doble de tripletes fúngicos en el cultivo incubado con fluconazol (a una concentración de 5 µg mL−1), en comparación con el cultivo de control, es decir, 8,96% y 4,70%, respectivamente. También se formaron menos cuatrillizos en los cultivos incubados con Venetin-1 y fluconazol. El porcentaje de pequeños agregados (compuestos por menos de 10 células) no difirió entre el cultivo control y los cultivos tratados con Venetin-1 y fluconazol. Se observó un aumento significativo en la formación de grandes agregados (compuestos por 10 células y más) del 4,7 % en el cultivo de control al 18,24 % en el cultivo incubado con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL−1. El porcentaje de cadenas formadas en el cultivo celular incubado con fluconazol (20 µg mL−1) también cambió (de 1,34 a 17,14%) con respecto al cultivo control. También se observó un aumento significativo del número de hifas/pseudohifas tras la incubación con ambos preparados, alcanzando el 4,7% en el cultivo control, el 30,19% en el cultivo incubado con Venetin-1 (a 100 µg mL−1) y el 22,86% tras la incubación con fluconazol (a 20 µg mL−1) (fig. 1).

Imágenes de agregados de células de C. albicans después de la tinción con blanco de Calcofluor: (A1)–(A2)-células de control de C. albicans; (B)- Células de C. albicans después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL−1; (C)- Células de C. albicans después de la incubación con fluconazol a 20 µg mL-1. La barra de escala representa 5 µm.

Tipos de agregados en el cultivo control de C. albicans y cultivos incubados con diferentes concentraciones de Venetina-1 y fluconazol. Los colores presentados en el panel superior corresponden a los colores de los gráficos circulares. La barra de escala representa 2 µm.

La tinción con rojo Congo del control mostró que las células eran redondas u ovaladas con una ligera fluorescencia roja de la pared celular (Fig. 3 IA). Las células observadas después de la incubación con Venetina-1 a una concentración de 25 µg mL-1 fueron de mayor tamaño, con mayor fluorescencia (Fig. 3 IB). La imagen IC muestra cambios en la forma de las células, así como un aumento en su tamaño después del tratamiento con Venetin-1 a 50 µg mL−1 (Fig. 3 IC). Se observaron células no separadas y fluorescencia roja en toda la superficie celular después de la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL−1 (Fig. 3 ID). Los cultivos sometidos al tratamiento con fluconazol a concentraciones de 5 y 10 µg mL−1 presentaron cambios en la forma y tamaño de las células y cadenas ramificadas de células no separadas con fluorescencia más brillante que en los cultivos control (Fig. 3 I E -F). Los cultivos incubados con fluconazol a 20 µg mL−1 tenían además conexiones fluorescentes entre las células formadoras de cadena (Fig. 3 IG). Además, en esta muestra se observaron pseudohifas y células con cicatrices de brotes. La incubación con todas las concentraciones de fluconazol no resultó en una fluorescencia más fuerte, en comparación con la observada después del uso de Venetin-1.

Células IC albicans después de la incubación con Venetin-1 y fluconazol, teñidas con colorante rojo Congo: (A) - células del cultivo de control; (B)—células después de la incubación con Venetin-1 a 25 µg mL−1; (C)—con Venetin-1 a 50 µg mL−1; (D)—con Venetin-1 a 100 µg mL−1; (E)—células después de la incubación con fluconazol a 5 µg mL−1; (F)—con fluconazol a 10 µg mL−1; (G)—con fluconazol a 20 µg mL−1. La barra de escala representa 10 µm. II. Imágenes crio-SEM de células de C. albicans; A–A1—células del cultivo control, B–B1—células después de la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL-1. La barra de escala representa 1 µm.

Se utilizó la técnica Cryo-SEM para visualizar la superficie de la pared celular. Las imágenes de la Fig. 3 II A, A1 muestran la superficie de la pared celular de C. albicans en el cultivo de control. La superficie era claramente grumosa. El uso de Venetin-1 en la concentración más alta (100 µg mL−1) tuvo un efecto de alisado de la superficie de la pared, lo que puede indicar una alteración en la estructura de la pared del hongo (Fig. 3 II B, B1).

El uso de la mezcla de Hoechst 33342 y yoduro de propidio facilitó la discriminación entre células normales, apoptóticas y necróticas. Los núcleos de células normales mostraron fluorescencia azul y tenían una forma regular. Las células apoptóticas tenían material genético fragmentado con una fluorescencia blanco-azul brillante, mientras que las células necróticas se caracterizaban por el color rojo del material nuclear.

Las células de C. albicans de control tenían núcleos ovalados con fluorescencia azul (Fig. 4 I A1–A3 y II A1–A3). Las células tratadas con Venetin-1 a la concentración de 50 µg mL−1 tenían material genético distribuido sobre la unión de dos células, es decir, células madre e hija, lo que sugiere alteraciones en el proceso de división celular (Fig. 4 I B1–B3, marcado con flechas amarillas). Las células después de la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL−1 mostraron una separación incompleta de las células entre sí, como lo indican las flechas blancas en la Fig. 4 I C1–C3. Las células apoptóticas con un núcleo fragmentado se muestran en la Fig. 4 I C1-C2 y se indican con una flecha naranja.

Células de C. albicans después de la incubación con Venetin-1 y fluconazol teñidas con una mezcla de colorantes Hoechst 33342 y yoduro de propidio; I- A1–A3—células de cultivo de control; B1–B3—células después de la incubación con Venetin-1 a 50 µg mL−1; C1–C3—con Venetin-1 a 100 µg mL-1; II- A1–A3—células de cultivo de control, B1–B3—células después de la incubación con fluconazol a 10 µg mL−1, C1–C3—con fluconazol a 20 µg mL-1. Las flechas amarillas indican material genético no separado de las células después de la división celular; las flechas blancas indican separación incompleta de células después de la división; las flechas naranjas muestran células apoptóticas. La barra de escala representa 5 µm.

Las células después del tratamiento con fluconazol también mostraron una separación incompleta que resultó en la formación de cadenas, como lo indican las flechas blancas tanto a 10 µg mL−1 (Fig. 4 II B1–B3) como a 20 µg mL−1 (Fig. 4 II C1-C3). La flecha naranja en la Fig. 4 II B2 indica el núcleo de una célula apoptótica.

Las imágenes presentadas muestran el efecto de la división celular alterada después de la aplicación de Venetin-1 y fluconazol; sin embargo, solo se observaron alteraciones en la separación del material nuclear durante la división celular después de la aplicación de Venetin-1. Después de la aplicación de fluconazol, las células formaron cadenas, pero no se observó material genético en la constricción intercelular. Estas observaciones indican un mecanismo de acción diferente de ambas preparaciones, a pesar de las observaciones microscópicas similares.

Las células de C. albicans en proceso de gemación también se analizaron mediante las técnicas microscópicas SEM y Cryo SEM (Fig. 5). En la imagen de la Fig. 5A se muestra una sección transversal de las células del cultivo de control. Es visible una brotación adecuada, en la que el material genético está completamente separado entre las células madre e hija (área marcada con un cuadrado). Las células sometidas a la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL−1 se visualizan en la imagen de la Fig. 5B. Esta foto muestra material genético separado de forma incompleta entre la célula madre y la célula hija (marcada con un marco blanco), que corresponde a las imágenes que se muestran en la Fig. 4I. Las imágenes SEM del cultivo de control muestran una división celular normal con un anillo de división claramente visible (Fig. 5C). La imagen de la Fig. 5 D muestra células de levadura después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL−1 con separación celular incompleta. Las imágenes SEM están de acuerdo con las imágenes obtenidas con el método Cryo-SEM.

Células de C. albicans fotografiadas por Cryo-SEM (A, B) y SEM (C, D): (A): sección transversal de células de C. albicans en ciernes del cultivo de control; (B)—sección transversal de células de C. albicans en gemación después de la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL−1; (C)- células de C. albicans del cultivo de control; (D)—células después de la incubación con Venetin-1 a 100 µg mL−1. La barra de escala representa 2 µm.

El análisis realizado con el colorante Rodamina 123 visualizó las mitocondrias de las células de control como pequeños puntos verdes ubicados en la periferia interna de las células (Fig. 6A). Las células del control negativo incubadas con azida de sodio no emitieron fluorescencia observable (Fig. 6B1). La imagen de la Fig. 6 B2 es equivalente a la imagen B1 del microscopio de luz transmitida. Después de la incubación con Venetin-1 a 25 µg mL−1 se observaron células con mitocondrias alargadas (Fig. 6C1–C2, marcadas con flechas blancas) y células con mitocondrias normales (Fig. 6C1–C2, marcadas con flechas amarillas). Después de aplicar Venetin-1 en una cantidad de 50 µg mL−1, las mitocondrias a menudo se visualizaban como estructuras luminosas verdes largas y plegadas que llenaban la luz celular (Fig. 6D1-D2). El cultivo sometido a la acción de Venetin-1 a 100 µg mL−1 exhibió además células sin fluorescencia interna, lo que sugiere que sus mitocondrias estaban inactivas (Fig. 6E1–E2, marcadas con flechas rojas). Las células con mitocondrias alargadas están marcadas con flechas blancas en las mismas imágenes. La incubación con fluconazol no indujo cambios significativos en el tamaño o localización de las mitocondrias (Fig. 6F-H). Algunas células exhibieron una fluorescencia verde intensa debido a la alta captación del fluorocromo, que fue causada por el aumento de la permeabilidad de la membrana celular después del tratamiento con fluconazol.

Tinción con rodamina 123 de células de C. albicans. (A)—células de control positivo con mitocondrias pequeñas y redondas; (B1)–(B2): células de control negativas tratadas con azida de sodio. La imagen (B2) es una visualización de células en el microscopio de luz transmitida, equivalente a la imagen (B1) del microscopio de fluorescencia. (C1)–(C2)—C. células albicans tratadas con Venetin-1 a 25 µg mL−1, (D1)–(D2)—con Venetin-1 a 50 µg mL−1, (E1)–(E2)—con Venetin-1 a 100 µg mL− 1; (F)–C. células albicans tratadas con fluconazol a 5 µg mL−1, (G)—con fluconazol a 10 µg mL−1, (H)—con fluconazol a 20 µg mL−1. Las flechas amarillas muestran células con una forma normal de mitocondrias; las flechas blancas indican células con mitocondrias alargadas; las flechas rojas indican células que no emiten ninguna fluorescencia interna debido a mitocondrias inactivas. La barra de escala representa 10 µm.

Se utilizó citometría de flujo para analizar las mitocondrias activas con rodamina 123, y los resultados se presentan en la Fig. 7a. Los diagramas de puntos superiores muestran diferencias entre los cultivos en regiones cerradas: R1: células regulares, R2: agregados y R3: células con mitocondrias activas. En la región R3, que no está contenida en R1, las mitocondrias de las células son anormales. El porcentaje de células activas (Puerta R3) en todos los cultivos fue similar: 60,9% en el cultivo control, 64,34% tras la incubación con Venetin-1 (a 100 µg mL−1), y 66,22% en el tratamiento con fluconazol (a 20 µg mL−1). Se observó una diferencia significativa en el número de células regulares después del tratamiento con Venetin-1 (36,1 %) en comparación con las células del cultivo de control (52,7 %) y las células tratadas con fluconazol (57,64 %). Los cambios en la puerta R2 también fueron claramente visibles, con valores de 6,38 % en el cultivo de control, 8,42 % en las células tratadas con Venetin-1 y 0,22 % en el cultivo incubado con fluconazol.

(a) Análisis de citometría de flujo de mitocondrias activas con Rodamina 123. Dot-plots del cultivo control, células después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL-1, y en la variante con fluconazol a 20 µg mL-1. R1- células con mitocondrias regulares; R2-áridos; R3- células con mitocondrias activas. ( b ) Regiones cerradas después del análisis de citometría de flujo: células R1 con mitocondrias regulares; R2-áridos; R3- células con mitocondrias activas. Los histogramas presentan el perfil de los cultivos celulares en las regiones seleccionadas. Verde—muestra de control, rojo—glóbulos después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL-1, púrpura—células sometidas a fluconazol a 20 µg mL−1.

La dispersión lateral se relaciona con la complejidad o granularidad de la célula, incluidas las mitocondrias. Los histogramas (Fig. 7b) presentan diferentes perfiles en el cultivo celular incubado con Venetin-1, lo que indica que la estructura de las mitocondrias cambió después del tratamiento con la preparación. Las observaciones no mostraron cambios en la morfología mitocondrial después del tratamiento con fluconazol, en comparación con el cultivo fúngico de control.

La microscopía de contraste de fase es un método útil para la observación de objetos que no muestran un contraste natural, incluidas las vacuolas celulares. La imagen microscópica de las células de C. albicans de control reveló células con la forma ovalada correcta (Fig. 8A1-A2). Las células expuestas al complejo Venetin-1 en concentraciones de 25, 50 y 100 µg mL−1 se caracterizaron por vacuolas agrandadas observadas tanto en las células blastoconidiales como en las hifales (Fig. 8B1–B2, C1–C2, D1–D2, las vacuolas cambiadas se indican con flechas). Además, las vacuolas alteradas eran más numerosas y llenaban la mayor parte de la célula tratada (Fig. 8B2, D1-D2). A su vez, el fluconazol no provocó la formación de vacuolas agrandadas en las células de C. albicans a ninguna de las concentraciones utilizadas (5, 10, 20 µg mL−1), pero hubo células con numerosas granularidades y un tamaño significativamente agrandado, en relación con las células de control (Fig. 8E1–E2, F1–F2, G1–G2).

Microscopía de contraste de fase de células de C. albicans. (A1)–(A2)—C. células de control de albicans; (B1)–(B2)—C. albicans después de la incubación con Venetin-1 a 25 µg mL−1; (C1)–(C2)—con Venetin-1 a 50 µg mL−1; (D1)–(D2)—con Venetin-1 a 100 µg mL−1; (E1)–(E2)—C. albicans después de la incubación con fluconazol a 5 µg mL−1; (F1)–(F2)—con fluconazol a 10 µg mL−1; (G1)–(G2)—con fluconazol a 20 µg mL−1. Las flechas indican vacuolas agrandadas en células de C. albicans después de la acción del complejo Venetin-1. La barra de escala corresponde a 5 µm.

Se utilizó la técnica de citometría de flujo para analizar la viabilidad de las células tratadas con Venetina-1 y fluconazol (fig. 9). La imagen de citometría de flujo de las células de cultivo de control se muestra en la imagen IA; la viabilidad se estimó en 76,68%. Las imágenes de las Fig. 9B1–B3 muestran los datos obtenidos del análisis de los cultivos celulares incubados con Venetin-1 a las concentraciones finales de 25 µg mL−1 (Fig. 9a B1), 50 µg mL−1 (Fig. 9a B2) , y 100 µg mL−1 (Fig. 9a B3). El porcentaje de células apoptóticas fue del 17,18 % después del tratamiento con Venetin-1 a 25 µg mL−1 (Fig. 9a B1), 56,91 % a 50 µg mL−1 (Fig. 9a B2) y 50,78 % a 100 µg mL−1 −1 (figura 9a B3). La imagen de la Fig. 9a B3 muestra un grupo separado de células muertas. Los diagramas de puntos en la Fig. 9a C1–C2 y C3 presentan los datos obtenidos después del análisis de las células incubadas con fluconazol en las concentraciones de 5, 10 y 20 µg mL−1. El porcentaje de células apoptóticas aumentó con el aumento de la concentración de fluconazol y ascendió a 22,11 % en el cultivo celular incubado con fluconazol a 5 µg mL−1, 26,88 % a 10 µg mL−1 y 58,41 % a 20 µg mL−1. La Figura 9b muestra el número total de células control y en los cultivos sometidos a las diferentes concentraciones de Venetin-1 y fluconazol. Hubo una diferencia significativa entre las células tratadas y no tratadas.

(a) Datos de citometría de flujo de cultivos celulares de C. albicans: (A) - cultivo celular de control; (B1)—cultivo celular tratado con Venetin-1 a 25 µg mL−1, (B2)—con Venetin-1 a 50 µg mL−1, (B3)—con Venetin-1 a 100 µg mL−1; (C1)—cultivo celular tratado con fluconazol a 5 µg mL−1; (C2)—con fluconazol a 10 µg mL−1, (C3)—con fluconazol a 20 µg mL−1. El color rojo corresponde a células viables y el color negro indica células apoptóticas. (b) número total de células en los cultivos. Control: control de células de C. albicans; V25, V50, V100—C. células albicans tratadas con Venetin-1 a 25, 50, 100 µg mL-1; FL5, FL10, FL20—células tratadas con fluconazol a 5, 10, 20 µg mL−1; *** P < 0,01 (prueba HSD Tukey).

Se analizaron tres regiones espectrales en el espectro FTIR: en el rango de 3200–2800 cm−1, 1720–1400 cm−1 y 1200–950 cm−1 (Fig. 10). Las señales características de las vibraciones correspondientes a los enlaces que ocurren en los lípidos se observaron en el rango de 3200–2800 cm−1 en el espectro FTIR. El rango de 1720 a 1400 cm−1 exhibió picos correspondientes a las vibraciones características de los enlaces que ocurren en las proteínas, mientras que las bandas características de los polisacáridos se observaron en el rango de 1200 a 950 cm−1. Las pruebas mostraron un aumento en las señales en la región de 2800–3500 cm−1 después del tratamiento de la muestra de C. albicans con Venetin-1 a 100 µg mL−1 (Fig. 10). También se observó una caída significativa en las señales a 900–1800 cm−1. En el caso del tratamiento de la muestra de C. albicans con fluconazol 20 µg mL−1, se observó una disminución de la intensidad de la señal solo en el rango de 1800-1200 cm−1. Con base en los datos de la literatura, las señales seleccionadas se analizaron con la asignación de enlaces químicos característicos. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Espectro FTIR para el cultivo control de C. albicans (Control) y después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL−1 (V100) y fluconazol a 20 µg mL−1 (FL20).

En estudios anteriores se reveló que el complejo obtenido del líquido celómico de D. veneta actúa sobre la pared celular y la membrana de C. albicans. Su efecto se comparó con el del fluconazol, cuya acción es bien conocida. El fluconazol es un fármaco antifúngico azol del grupo de los derivados de triazol. El mecanismo de acción de los fármacos que pertenecen a este grupo de compuestos sintéticos se basa en la inhibición de la enzima responsable de la biosíntesis del ergosterol, que es uno de los componentes que construyen la membrana celular fúngica10,45. Esta alteración metabólica aumenta la permeabilidad de la membrana celular. La membrana celular pierde sus funciones protectoras y la célula deja de crecer, lo que provoca la muerte del hongo.

Los medicamentos y antibióticos actuales se están volviendo menos efectivos contra los patógenos. Esto está relacionado con el hecho de que los hongos están desarrollando resistencia a los antibióticos frente a fármacos de uso común como los azoles46. El fluconazol es un medicamento de primera elección en el tratamiento antifúngico. La ingesta prolongada o numerosos tratamientos con este antibiótico pueden provocar resistencia a Candida47,48,49. El fluconazol se usa para la profilaxis de micosis en pacientes inmunocomprometidos, incluidos pacientes en unidades de cuidados intensivos, pacientes con trasplante de órganos y aquellos que reciben quimioterapia y radioterapia. Se ha informado que los aislados clínicos de C. albicans son resistentes al fluconazol en aprox. 30–40%50,51. Se ha demostrado que existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas preparaciones antifúngicas que puedan administrarse a pacientes con infección por C. albicans.

El entorno natural siempre ha sido fuente de inspiración en la búsqueda de sustancias con propiedades beneficiosas. Se pueden encontrar en todos los reinos de la vida: las bacterias y los hongos producen antibióticos, mientras que los aceites esenciales y una variedad de moléculas beneficiosas se pueden extraer de las plantas45. Los animales también producen sustancias que han sido mejoradas durante su evolución para protegerlos de enfermedades. Las lombrices de tierra, que se encuentran entre los animales más longevos de la Tierra, son tales organismos.

En nuestros estudios previos34, describimos células de C. albicans teñidas con el fluorocromo blanco Calcofluor después de la acción de la fracción proteína-polisacárido del líquido celómico de lombriz. Se observó que la pared celular se tiñó de manera desigual, lo que indica un grosor diferente de la capa de quitina en la pared celular de las células de levadura tratadas con el agente activo. En el presente estudio, también se obtuvieron imágenes microscópicas de la formación de diferentes agregados celulares. El tipo y la cantidad de agregados multicelulares se analizaron tanto tras la incubación con el complejo como tras la incubación con fluconazol. Estos análisis mostraron diferencias en el número de formaciones multicelulares, lo que indica un mecanismo de acción diferente contra la pared celular de C. albicans. Esto también fue confirmado por los otros análisis.

El fluorocromo rojo Congo se utilizó simultáneamente en los análisis. Puede formar un complejo con (1,3)-β-glucano, lo que hace que la superficie de las paredes de las células fúngicas emita una fluorescencia roja bajo un microscopio de fluorescencia. El complejo Venetin-1 provocó la exposición de (1,3)-β-glucano, mientras que el fluconazol no expuso este componente de la pared celular. Se observó una ligera fluorescencia solo en las cicatrices de la división. Podría estar relacionado con el fenómeno descrito por Pfaller y Riley52 de que las células de C. albicans tratadas con fluconazol contienen significativamente menos glucano en sus paredes. Mucha investigación ha investigado la acción sinérgica de varios compuestos con fluconazol para exponer la capa de β-glucano47,53,54,55. En nuestro caso, esta exposición se observó solo después de la acción del complejo, lo que fue confirmado por Cryo-SEM. El aplanamiento de la capa más externa de las células tratadas con Venetin-1 puede indicar la destrucción de la capa de manoproteínas debajo de la cual se encuentra la capa de β-glucanos, lo que explica la fluorescencia roja observada después de usar el fluorocromo rojo Congo. El reconocimiento del componente β-glucano de la pared celular fúngica es un elemento clave del sistema inmunitario del huésped; por lo tanto, los compuestos que exponen el glucano pueden convertirse en fármacos valiosos53,56.

Las pruebas espectroscópicas FTIR de C. albicans realizadas después de la aplicación de Venetin-1 mostraron una disminución en la intensidad de la señal en el rango de 1720-1400 cm-1 y 1200-950 cm-1. Estas bandas corresponden a vibraciones características de los enlaces químicos que se encuentran en proteínas y polisacáridos, que son componentes de la pared celular de C. albicans. La disminución de la intensidad de los picos característicos de las proteínas puede indicar destrucción de la capa de manoproteínas de la pared celular de C. albicans como consecuencia de la acción de Venetin-1. También se observó una disminución en la intensidad de las señales características de los polisacáridos, que también son un componente de la pared celular de C. albicans. Las imágenes Cryo-SEM también mostraron tal efecto de destrucción de la pared celular. Los estudios espectroscópicos FTIR también mostraron un aumento en la intensidad de las señales correspondientes a las vibraciones características de los enlaces que ocurren en los lípidos. Esto confirma la hipótesis sobre la destrucción de la capa de manoproteína y la capa de β-glucano de la pared celular de C. albicans y la exposición de la capa lipídica de la membrana celular.

El efecto del complejo en la pared celular y la membrana de las células de C. albicans se puede ver en el análisis de las células fúngicas usando microscopía de contraste de fase, donde se observaron células con vacuolas anormalmente agrandadas, lo que sugiere cambios en la permeabilidad de la membrana. No se observó tal efecto después de la incubación de las células fúngicas con fluconazol, lo que indica un mecanismo de acción diferente de este antibiótico. Teniendo en cuenta nuestros estudios anteriores, que mostraron que la lisenina y la proteína 2 relacionada con la lisenina son las principales proteínas que forman el complejo39, la teoría sobre los cambios en la permeabilidad de la membrana celular es comprensible. Se sabe que las proteínas de lisenina están implicadas principalmente en la defensa frente a patógenos tanto eucariotas como procariotas. La lisenina se une al receptor de membrana esfingomielina. Al unirse a la membrana después del cambio conformacional, el oligómero se incorpora a la membrana57.

Los trastornos de la división celular también se analizaron utilizando una mezcla de Hoechst y yoduro de propidio, que puede marcar el material genético y mostrar células apoptóticas y necróticas. Durante la correcta división en la célula madre, tiene lugar la división mitótica del núcleo en dos células. Un núcleo, junto con parte del citoplasma, se difunde en el bulto resultante llamado brote. El brote crece gradualmente y se separa de la célula madre por la pared celular. En las células tratadas con el complejo de líquido celómico, a menudo se observó material genético no distribuido entre las células madre e hija. Las células hijas crecieron sin dividirse de la célula madre y el material nuclear era visible en la constricción entre las células. Este efecto no se observó en el caso de incubación con fluconazol. Las secciones de células fúngicas tratadas con Venetin-1 y fotografiadas por Cryo-SEM y SEM mostraron una separación celular incompleta durante la brotación, en comparación con las células de control, donde la pared celular y la membrana separaron claramente las células durante la división. Después de la acción del complejo, la célula hija creció hasta alcanzar un tamaño grande, incapaz de separarse de la célula madre y, como resultado, eran visibles los dobletes celulares con una constricción entre las células. Esto indica una división anormal del material nuclear con una alteración simultánea de la pared y el sistema de membranas. La célula creció con un déficit de los componentes necesarios para completar la división de la célula hija. Las células de C. albicans tratadas con fluconazol sufrieron división con separación completa del material nuclear entre las células, lo que es confirmado por los datos de la literatura34.

Los datos obtenidos después de la tinción con rodamina 123 mostraron que las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 tenían cambios claramente visibles en la forma de la mitocondria y se caracterizaban por la pérdida del potencial de membrana mitocondrial. La investigación realizada por Fiołka et al.39 demostró que las células fúngicas tratadas con el complejo tenían niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS) y un nivel más alto de proteínas involucradas en la degradación de ROS. El estrés oxidativo puede provocar daños en el ADN, las proteínas y los compuestos lipídicos de las estructuras celulares58. Un aumento del nivel de ROS en la mitocondria conduce a la apertura de los canales iónicos de la membrana mitocondrial y, en consecuencia, a un fenómeno llamado RIRR (liberación de ROS inducida por ROS), donde la interrupción del potencial de la membrana mitocondrial provoca una mayor producción de ROS en el transporte de electrones. cadena59,60. El estrés oxidativo puede provocar apoptosis o necrosis de las células, y se observaron ambas formas de muerte celular después del tratamiento de C. albicans con Ventin-1 (anteriormente descrito como fracción de fluido celómico)34,39,60. Las células de C. albicans tratadas con fluconazol no mostraron ningún cambio en la morfología mitocondrial en la tinción con rodamina 123. El efecto sobre las mitocondrias que ejerce el estrés oxidativo inducido por el tratamiento con fluconazol se basa en el deterioro de su función al suprimir el transporte de electrones mitocondriales, que es reversible61,62,63,64. La pérdida temporal de la función mitocondrial se describe en la literatura como el mecanismo de resistencia a fluconazol62,65.

Tanto el complejo Venetin-1 como el fluconazol indujeron la formación de agregados multicelulares; sin embargo, la citometría de flujo reveló diferencias entre los cultivos celulares. El análisis de viabilidad de C. albicans se realizó solo en células que no formaban grandes aglomerados o estructuras multicelulares complejas, porque el diseño del citómetro permite análisis de células individuales. Sin embargo, en el caso de la acción del complejo y la acción del fluconazol, el efecto de formación de agregados es similar, y los resultados de la citometría de flujo pueden compararse entre sí, porque se aplicaron configuraciones de análisis idénticas en cada experimento.

El análisis de mitocondrias activas realizado con citometría de flujo mostró diferencias entre cultivos celulares tratados con Venetin-1 y fluconazol. A pesar de los niveles similares de células con mitocondrias activas, el tratamiento con el complejo de líquido celómico redujo el porcentaje de células regulares. Esto indica que Venetin-1 provocó alteraciones en las mitocondrias, mientras que fluconazol no. Esto sugiere que el mecanismo de acción de Venetin-1 difiere del de fluconazol. Los resultados de la citometría respaldan las observaciones de las células teñidas con rodamina 123 examinadas por microscopía de fluorescencia, en particular la elongación de las mitocondrias en los cultivos tratados con Venetin-1 y ningún efecto visible en las mitocondrias después de la incubación con fluconazol.

El análisis de viabilidad celular realizado mediante citometría de flujo mostró un nivel similar de células apoptóticas en los cultivos incubados con Venetin-1 a 100 µg mL−1 y fluconazol a 10 µg mL−1. Los datos obtenidos en este experimento también mostraron que la concentración más alta de Venetin-1 provocó la muerte celular necrótica, que no se observó después del tratamiento con fluconazol. Ambas preparaciones redujeron significativamente el número de células, en comparación con el cultivo de control.

En la búsqueda de nuevas terapias para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, la cuestión clave es la falta de citotoxicidad que limitaría su aplicabilidad. En el caso del fluconazol, existen reportes de hepatotoxicidad y neurotoxicidad66,67, así como efectos citotóxicos y genotóxicos en la línea celular de riñón de mono68 y células mononucleares de sangre periférica humana cultivadas69. A su vez, nuestra investigación anterior indica que el fluido celómico de D. veneta tratado térmicamente y Venetin-1 no tienen efectos citotóxicos contra los fibroblastos humanos70, las células epiteliales del colon humano normal (CCD 841 CoTr)36, el plasma rico en plaquetas humano37 y el tejido bronquial humano. células epiteliales (BEAS-2B)35. Al buscar nuevas terapias para uso en medicina, se debe tener en cuenta no solo la acción efectiva y la falta de citotoxicidad, que salva las células normales, sino también los costos y la eficiencia del método para el aislamiento del compuesto activo. Teniendo en cuenta estos requisitos, el complejo Venetin-1 obtenido del fluido celómico cumple idealmente con los requisitos para un candidato a la investigación biomédica. En análisis posteriores, tenemos la intención de explorar los efectos del complejo en varias especies de Candida, explorar la estructura del complejo y analizar su acción en un organismo vivo en un modelo de ratón.

En resumen, la preparación de lombrices de tierra analizada con un mecanismo de acción diferente al de un antibiótico típico impulsa más investigaciones al respecto, ya que parece ser un compuesto antifúngico prometedor.

Los datos sin procesar utilizados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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La investigación presentada fue apoyada por el Proyecto del Centro Nacional de Ciencias, Polonia [2020/37/B/NZ7/00763].

Departamento de Inmunobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Facultad de Biología y Biotecnología, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Sylwia Wójcik-Mieszawska y Marta J. Fiołka

Departamento de Biología Celular, Instituto de Ciencias Biológicas, Facultad de Biología y Biotecnología, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Kinga Lewtak

Laboratorio analítico, Instituto de Ciencias Químicas, Facultad de Química, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Weronika Sofińska-Chmiel

Departamento de Anatomía Funcional y Citobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Facultad de Biología y Biotecnología, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Jerzy Widrych

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SWM y MJF escribieron el texto principal del manuscrito y prepararon Venetin-1 para la investigación; SWM preparó citometría de flujo y preparó la Tabla 1, Figs. 1, 2, 3 1, 6, 7, 9; Higos preparados por MF. 3. 1, 4, 5; WSC preparó el análisis espectroscópico y la Fig. 10, Tabla 2; KL preparar Fig. 8; JW realizó un análisis microscópico. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Marta J. Fiołka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wójcik-Mieszawska, S., Lewtak, K., Sofińska-Chmiel, W. et al. Cambios atípicos en células de Candida albicans tratadas con el complejo Venetin-1 del líquido celómico de lombriz. Informe científico 13, 2844 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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Recibido: 21 noviembre 2022

Aceptado: 09 febrero 2023

Publicado: 17 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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