Dos receptores odorantes regulan 1 | Beijing AgileLift Ventures Group Co., Ltd.

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 176 (2023) Citar este artículo

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La mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis (Hendel) es una plaga notoria de los cultivos frutales. Las hembras grávidas localizan los sitios de oviposición adecuados detectando los volátiles de la planta huésped. Aquí, demostramos que el 1-octen-3-ol, un volátil del mango, guía el comportamiento de oviposición de las moscas hembra. Se identifican dos receptores odorantes (BdorOR7a-6 y BdorOR13a) como receptores clave para la percepción del 1-octen-3-ol mediante análisis de qPCR, expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laevis y células HEK 293 seguido de ensayos de unión in vitro, así como CRISPR/ Edición del genoma Cas9 en B. dorsalis. El acoplamiento molecular y la mutagénesis dirigida al sitio se utilizan para determinar los principales sitios de unión para el 1-octen-3-ol. Nuestros resultados demuestran el potencial del 1-octen-3-ol para atraer hembras grávidas y el mecanismo molecular de su percepción en B. dorsalis. Por lo tanto, BdorOR7a-6 y BdorOR13a pueden usarse como dianas moleculares para el desarrollo de atrayentes femeninos. Además, nuestros datos de mutagénesis dirigida al sitio facilitarán la ingeniería química de 1-octen-3-ol para generar atrayentes más eficientes.

La selección de sitios de oviposición adecuados por parte de los insectos herbívoros generalmente refleja la capacidad de las hembras grávidas para detectar los volátiles liberados por las plantas hospedantes preferidas. Los ejemplos incluyen la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, que detecta los terpenos liberados por la fermentación de las frutas1,2, la mosca de la semilla de frijol Delia platura, que detecta el 1-octen-3-ol y el 3-octanona liberados por la germinación de las semillas3, la polilla del gusano de seda Bombyx mori, que detecta los volátiles liberados por las hojas de morera4, y la avispa parásita Anastatus japonicas, que detecta el β-cariofileno, el α-farneseno y el cis-3-hexen-ol liberados por las plantas hospedantes y los insectos5. La mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis (Hendel), una de las plagas más destructivas e invasoras de los cultivos frutales6, prefiere poner sus huevos en frutos de mango completamente maduros7,8,9,10. Se cree que esto refleja la atracción de las hembras grávidas por los volátiles. El químico 1-octen-3-ol, un volátil de la fruta del mango, fue considerado como una de las posibles señales de orientación para la selección del sitio de oviposición en esta mosca11,12.

El sistema olfativo de los insectos juega un papel importante en el uso de volátiles para guiar el comportamiento de oviposición13,14,15. Los receptores de olores (OR) responsables de la percepción de volátiles específicos se pueden determinar mediante una combinación de pruebas de comportamiento basadas en la exposición y mutaciones de pérdida de función, con ensayos de unión directa y mutagénesis dirigida al sitio como estrategia para identificar sitios de unión específicos16 . Habiendo caracterizado los volátiles y sus receptores, la ecología química inversa se puede utilizar para desarrollar atrayentes novedosos que se dirijan a los OR clave de manera más eficiente13,17,18,19. Por ejemplo, se descubrió que DmelOR19a es responsable de la percepción de los terpenos cítricos que controlan el comportamiento de oviposición en D. melanogaster2. De manera similar, se descubrió que HassOR31 guía el comportamiento de puesta de huevos de Helicoverpa assulta en respuesta al butirato de Z-3-hexenilo liberado por las plantas hospedantes13. Además, descubrimos que la eliminación del gen del receptor coexpresado del receptor olfativo (BdorOrco) mediante el sistema CRISPR/Cas9 eliminó la preferencia de oviposición inducida por 1-octen-3-ol en hembras B. dorsalis20. El estudio anterior también mostró directamente que BdorOR13a se une al 1-octen-3-ol in vitro16, pero hasta el momento no se han presentado datos de comportamiento in vivo. Un análisis adicional de la percepción de 1-octen-3-ol en B. dorsalis se ha visto obstaculizado por un conjunto de datos OR incompleto debido a la falta de una secuencia genómica de alta calidad.

Para abordar estos desafíos, anotamos de manera integral la familia B. dorsalis OR utilizando un nuevo ensamblaje de genoma de alta calidad. Identificamos dos OR que pueden estar involucrados en la respuesta al 1-octen-3-ol utilizando el análisis de expresión de OR en hembras vírgenes y apareadas, y probando los OR candidatos mediante sistemas de expresión heterólogos seguidos de ensayos de registro de tensión y de imágenes de calcio. Además, estos dos genes se eliminaron utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Utilizamos el análisis del sitio de unión y la mutagénesis dirigida al sitio para determinar el mecanismo de unión. También comparamos el efecto del 1-octen-3-ol en hembras grávidas y vírgenes. Nuestros resultados indican el mecanismo molecular de la percepción del 1-octen-3-ol en B. dorsalis y proporcionan objetivos moleculares para el desarrollo de atrayentes femeninos más eficientes basados en la ingeniería química del 1-octen-3-ol.

Comparamos la capacidad de la pulpa de mango completamente madura y el 1-octen-3-ol para atraer hembras vírgenes y apareadas de B. dorsalis utilizando señuelos trampa. La pulpa de mango completamente madura (Fig. 1a) y el 10 % (v/v) de 1-octen-3-ol (diluido en aceite mineral (MO)) (Fig. 1b) fueron significativamente más atractivos para el cultivo de 15 días. hembras apareadas de edad que hembras vírgenes de 15 días y hembras inmaduras de 3 días, pero no hubo diferencia significativa entre las hembras vírgenes e inmaduras. Además, el índice de preferencia (el número de moscas en la trampa odorante menos el número de moscas en la trampa MO y luego dividido por el total de moscas introducidas) de las hembras grávidas tanto para el mango maduro como para el 1-octen-3-ol aumentó con el tiempo. Casi todas las hembras hicieron su elección después de ~8 h y permanecieron relativamente estables a partir de entonces.

a El índice de preferencia de pulpa de mango para hembras inmaduras de 3 días, hembras vírgenes de 15 días y hembras apareadas de 15 días. b El índice de preferencia de 1-octen-3-ol para hembras inmaduras de 3 días, hembras vírgenes de 15 días y hembras apareadas de 15 días. c Diagrama esquemático de la configuración experimental para ensayos de comportamiento de oviposición. d–g Comportamiento de oviposición inducido por mango y/o 1-octen-3-ol. El mapa de calor se basa en rastros de moscas monitoreados con el software EnthoVision XT. El esquema de color representa la densidad de las huellas y el tiempo empleado por ocho hembras, y el rojo indica la densidad más alta. Las imágenes muestran el grado de oviposición después de 24 h. Los histogramas muestran el número promedio de huevos puestos por cada hembra. Los datos son medias ± SE de n ≥ 7 réplicas biológicas. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de Student (***p < 0,001). d Pulpa de mango vs MO. e 1-octen-3-ol frente a MO. f Pulpa de mango vs 1-octen-3-ol. g Pulpa de mango + 1-octen-3-ol vs pulpa de mango + MO.

Estudiamos el efecto del mango maduro y el 1-octen-3-ol en el comportamiento de la oviposición utilizando el enfoque experimental que se muestra en la Fig. 1c. Brevemente, colocamos ~60 mg de pulpa de mango o 20 µL de solución de 1-octen-3-ol en un lado de una placa de Petri (punto L), y 20 µL MO en el lado opuesto (punto R), luego rastreamos el moscas. Cuando se colocó pulpa de mango en el punto L y MO en el punto R, el número medio de huevos puestos por cada hembra fue de 27 ± 8 (n = 7) en el punto L y casi cero en el punto R (p < 0,001, prueba t de Student) , y las huellas de las moscas se concentraron principalmente alrededor de la pulpa del mango (Fig. 1d). Se observaron resultados similares cuando se aplicó 1-octen-3-ol en el punto L y MO en el punto R (Fig. 1e). Cuando la pulpa de mango se probó directamente contra 1-octen-3-ol, las moscas pusieron significativamente más huevos en la región de 1-octen-3-ol (Fig. 1f). Además, las hembras grávidas mostraron una preferencia por la pulpa de mango suplementada con 1-octen-3-ol en comparación con la pulpa de mango suplementada con MO, y el número de huevos fue mayor en comparación con la pulpa de mango o el 1-octen-3-ol solo (Fig. 1g). Las huellas de moscas se concentraron alrededor del sitio de oviposición preferido en todos los experimentos. Estos resultados indicaron que el 1-octen-3-ol podría ser adecuado como señuelo para el control de hembras de B. dorsalis. El comportamiento de la oviposición se muestra con más detalle en las Películas complementarias 1–4.

Identificamos 74 genes OR de B. dorsalis mediante el uso de BLASTX para examinar contigs genómicos de B. dorsalis frente a secuencias de aminoácidos y dominios Pfam de OR conocidos de D. melanogaster con un límite de identidad del 30 % (Tabla complementaria 1, Datos complementarios 1) . Los contigs se derivaron de un ensamblaje del genoma de B. dorsalis final de alta calidad que se envió a CNGBdb (número de acceso CNP0003192). También incluimos varios transcriptomas de tejido de B. dorsalis, incluida la antena (GenBank SRR9026238), palpos maxilares y probóscide (número de acceso CNP0003333) y otros tejidos (número de acceso CNP0003334). Utilizamos una búsqueda BLASTN para predecir las secuencias de codificación completas de los OR y determinamos sus secuencias mediante RT-PCR. Una búsqueda de homología basada en las secuencias de aminoácidos de los OR de D. melanogaster reveló múltiples genes homólogos para varios OR, incluidos BdorOR7a, BdorOR33b, BdorOR59a, BdorOR63a, BdorOR67d y BdorOR94a, mientras que los OR de Drosophila correspondientes tienen solo un gen (Fig. 1 complementaria) .

Los perfiles de expresión de los genes OR de B. dorsalis se investigaron analizando siete tejidos en diferentes segmentos corporales de B. dorsalis mediante qPCR (Fig. 2 complementaria). La mayoría de los genes se expresaron fuertemente en tejidos ricos en sensilas, como los palpos maxilares, las cutículas de la cabeza y especialmente las antenas. También se expresaron varios genes en la probóscide, incluidos BdorOR7a-4, BdorOR19a, BdorOR24a, BdorOR47b y BdorOR94a-2. Comparamos los perfiles de expresión génica en hembras vírgenes y apareadas de 15 días de edad, revelando 20 genes que estaban significativamente regulados al alza y cinco genes que estaban significativamente regulados a la baja después del apareamiento (Fig. 3 complementaria). Dado que las hembras grávidas eran más sensibles al 1-octen-3-ol, consideramos los 20 genes OR regulados al alza como candidatos para el análisis de la afinidad de unión al 1-octen-3-ol.

Para determinar qué OR de B. dorsalis son los principales responsables de la percepción de 1-octen-3-ol, expresamos los 20 candidatos en ovocitos de Xenopus laevis junto con el gen correceptor BdorOrco, y utilizamos un sistema de fijación de voltaje de dos electrodos para registre la respuesta al 1-octen-3-ol. Los ovocitos de control inyectados con agua no generaron corrientes detectables cuando se los desafió con DMSO o 1-octen-3-ol (Fig. 2a). Entre los 20 OR candidatos, solo los ovocitos que expresaban BdorOR7a-6/BdorOrco o BdorOR13a/BdorOrco fueron claramente activados por 1-octen-3-ol, y en ambos casos observamos corrientes dependientes de la dosis (Fig. 2b, c). La mitad de la concentración efectiva máxima (valor EC50) de 1-octen-3-ol, que induce una respuesta a medio camino entre la línea de base y la máxima, fue de 105 μM para BdorOR7a-6/BdorOrco y 1,268 μM para BdorOR13a/BdorOrco. Por lo tanto, BdorOR13a parece tener una afinidad mucho mayor que BdorOR7a-6 por el 1-octen-3-ol.

Respuestas a–c a 1-octen-3-ol de ovocitos de Xenopus que expresan conjuntamente BdorOR7a-6/BdorOrco o BdorOR13a/BdorOrco. Se inyectaron ovocitos de Xenopus con las construcciones apropiadas y se estimularon con 1-octen-3-ol a diferentes concentraciones. Los ovocitos se inyectaron con (i) agua como control, (ii) cRNA de BdorOR7a-6/BdorOrco, (iii) cRNA de BdorOR13a/BdorOrco. b Curva dosis-respuesta de BdorOR7a-6 a 1-octen-3-ol. EC50 = 1,05 × 10−4 M. c Curva dosis-respuesta de BdorOR13a a 1-octen-3-ol. EC50 = 1,268 × 10−6 M. Los símbolos muestran las respuestas actuales del complejo BdorOR/BdorOrco presentado como media ± SE (n = 8). Las curvas de dosis-respuesta se ajustaron utilizando GraphPad 8.0. Respuestas d-h a 1-octen-3-ol de células HEK 293 que coexpresan BdorOR7a-6/BdorOrco o BdorOR13a/BdorOrco. d Imágenes de fluorescencia de células HEK 293 incubadas con Fluo4-AM y transfectadas con los genes OR candidatos. Se usó Fluo4-AM para indicar el cambio de fluorescencia (ΔF) a lo largo del tiempo, y se usó mCherry como indicador para observar las células transfectadas con éxito. La escala proporcional es de 50 μm. e Cambio en la intensidad de la fluorescencia de las células que expresan BdorOR7a-6/BdorOrco después de la estimulación con 10−4 M de 1-octen-3-ol. f Curva dosis-respuesta de BdorOR7a-6 a 1-octen-3-ol. EC50 = 1,561 × 10-5 M. g Cambio en la intensidad de fluorescencia de las células que expresan BdorOR13a/BdorOrco después de la estimulación con 10-4 M de 1-octen-3-ol. h Curva dosis-respuesta de BdorOR13a a 1-octen-3-ol. EC50 = 1,128 × 10−5 M.

Para confirmar los datos de sujeción de voltaje de dos electrodos, expresamos los OR en células HEK 293 y detectamos la capacidad de los OR para unir 1-octen-3-ol mediante imágenes de calcio. Las células incubadas con Fluo-4 AM eran verdes cuando se excitaban a 488 nm, mientras que las células transfectadas con éxito con las construcciones OR y el marcador visual mCherry eran rojas cuando se excitaban a 555 nm (Fig. 2d). Solo las células transfectadas con BdorOR7a-6/BdorOrco o BdorOR13a/BdorOrco mostraron un cambio significativo en la intensidad de la fluorescencia verde después de la estimulación con 1-octen-3-ol 10−4 M (Fig. 2e, g), y las curvas de concentración-respuesta revelaron Valores de EC50 de 15,6 μM para BdorOR7a-6/BdorOrco y 11,3 μM para BdorOR13a/BdorOrco (Fig. 2f, h).

Diseñamos ARNg contra los genes BdorOR7a-6 y BdorOR13a y los inyectamos en huevos de B. dorsalis recién puestos junto con proteína Cas9 purificada para generar mutaciones knockout. Los sitios objetivo BdorOR7a-6 y BdorOR13a se ubicaron en el primer y segundo exón, respectivamente (Fig. 3b, c). Obtuvimos 26 adultos en el grupo BdorOR7a-6 y 12 en el grupo BdorOR13a. Los individuos Mosaic G0 se identificaron en función del análisis de polimorfismos, y se encontró que la eficiencia de la mutación G0 era del 13% y el 22%, respectivamente (Fig. 3a). La clonación TA y la secuenciación de Sanger revelaron tres genotipos entre los mutantes G0 BdorOR7a-6–/+ y dos entre los mutantes G0 BdorOR13a–/+. Los mutantes se cruzaron individualmente con moscas de tipo salvaje (WT), y la descendencia G1 se retrocruzó con moscas WT durante al menos 10 generaciones para excluir posibles mutaciones fuera del objetivo. Finalmente, obtuvimos moscas BdorOR7a-6-/- con una deleción homocigota de 4 pb y moscas BdorOR13a-/- con una deleción homocigota de 7 pb (Fig. 3b, c). La secuencia de aminoácidos BdorOR7a-6 en los mutantes se alteró desde la posición 236 y creó un codón de terminación en la posición 254 (en comparación con la proteína WT de 394 residuos). La secuencia de aminoácidos de BdorOR13a en los mutantes se alteró desde la posición 127 y creó un codón de terminación en la posición 172 (en comparación con la proteína WT de 441 residuos).

a Tasas de supervivencia y mutagénesis después de la microinyección. b La región objetivo de BdorOR7a-6. ( i ) Estructura genética de BdorOR7a-6 basada en la secuencia del genoma. Los exones se muestran como cuadros grises y los intrones como líneas. El objetivo de gRNA en el primer exón contiene una secuencia guía de 20 nt y el CGG adyacente resaltado en verde es el motivo adyacente protospacer (PAM). (ii) Los genotipos de los mutantes G0 se determinaron mediante clonación TA y secuenciación de Sanger (las deleciones se muestran como guiones resaltados en amarillo). El identificador asignado a las moscas mosaico G0 se muestra al frente de cada secuencia, y el número de nucleótidos eliminados se muestra después de cada secuencia. (iii) Rastros de secuenciación de Sanger para moscas WT, BdorOR7a-6-/+ y BdorOR7a-6-/-. La región negra es el sitio objetivo del gRNA. (iv) Secuencias de proteínas predichas de los alelos BdorOR7a-6 WT y mutantes (-4 pb). c La región objetivo de BdorOR13a, donde (i–iv) indica los mismos detalles que los proporcionados anteriormente para los mutantes BdorOR7a-6.

Comparamos las respuestas electrofisiológicas de moscas mutantes y WT al 1-octen-3-ol y otros volátiles mediante electroantenografía (EAG). La respuesta EAG promedio de las moscas WT aumentó gradualmente con la concentración de 1-octen-3-ol (Fig. 4a), alcanzando un pico de 3.829 ± 0.33 mV al 10% (v/v) de 1-octen-3-ol. Las respuestas EAG promedio de los mutantes fueron significativamente más bajas al 0,1 %, 1 % y 10 % (v/v) de 1-octen-3-ol en comparación con las moscas WT. Además, las respuestas de EAG de los mutantes BdorOR13a-/- fueron más bajas que las de los mutantes BdorOR7a-6-/- al 1 % y al 10 % (v/v) de 1-octen-3-ol. Sin embargo, la respuesta de EAG de los mutantes BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/- a otros tres volátiles (tilato de etilo, acetato de etilo y butirato de etilo) no mostró diferencias significativas en comparación con las moscas WT.

Respuestas de EAG de mutantes WT, BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/- a diferentes concentraciones de 1-octen-3-ol y otros volátiles. Los datos son medias ± SE (n = 15–20). La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de Student (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). b Comportamiento de oviposición inducido por 1-octen-3-ol en hembras WT y mutantes. El mapa de calor muestra la densidad de huellas y el tiempo empleado por ocho hembras, con el rojo indicando la densidad más alta. Las imágenes muestran el grado de oviposición después de 24 h, y el histograma muestra el número promedio de huevos puestos por cada mosca. Los datos son medias ± SE (n ≥ 8 réplicas biológicas). La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de Student (***p < 0,001).

Se llevaron a cabo bioensayos de oviposición para comparar la eficiencia del 1-octen-3-ol como atrayente para las hembras WT y mutantes, utilizando la misma configuración experimental descrita anteriormente (Fig. 1c). El número medio de huevos puestos por cada hembra WT en el sitio de 1-octen-3-ol fue de 28 ± 3 (n = 12), en comparación con casi 0 (n = 12) huevos en el sitio tratado con MO (p < 0,001). , Prueba t de Student, Fig. 4b). Sin embargo, el número medio de huevos puestos en el sitio 1-octen-3-ol por las moscas mutantes fue significativamente menor: 4 ± 1 (n = 13, p < 0,001, prueba t de Student, Fig. 4b) para BdorOR7a-6 -/- mutantes y 2 ± 1 (n = 16, p < 0,001, prueba t de Student, Fig. 4b) para BdorOR13a-/- mutantes. No hubo diferencia significativa entre las moscas WT y las moscas mutantes en el sitio MO. Además, las huellas de los mutantes BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/- estaban desordenadas, cubriendo toda la placa de Petri, en contraste con las huellas WT concentradas alrededor del atrayente. Los comportamientos de los mutantes BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/- se muestran en las películas complementarias 5–6.

Usamos AlphaFold 2.0 para predecir las estructuras de BdorOR7a-6 y BdorOR13a (Fig. 5a, c). La precisión de la predicción se evaluó mediante un gráfico PROCHECK Ramachandran, que reveló que el 96,7 % de los residuos de BdorOR7a-6 se colocaron en regiones favorecidas (A, B, L) y no se colocaron residuos en regiones no permitidas (Fig. 4a complementaria). De manera similar, el 95,3% de los residuos de BdorOR13a se colocaron en regiones favorecidas y no se colocaron residuos en regiones no permitidas (Fig. 4b complementaria). El acoplamiento molecular mostró que BdorOR7a-6 y BdorOR13a presentan una cavidad alargada en forma de bolsillo que se une al 1-octen-3-ol. Se predijo que el residuo Asn86 de BdorOR7a-6 (Fig. 5b) y los residuos Asp320 y Lys323 de BdorOR13a (Fig. 5d) formarían enlaces de hidrógeno con 1-octen-3-ol. La veracidad de los tres sitios de unión se determinó mediante mutagénesis dirigida al sitio, en la que cada sitio se reemplazó individualmente con alanina. Las tres secuencias mutantes se transfectaron en células HEK 293 junto con la construcción BdorOrco, seguido de imágenes de calcio como se describe anteriormente. La mutación Asn86Ala redujo significativamente la afinidad de unión de BdorOR7a-6 por 1-octen-3-ol, aumentando el valor de EC50 a 46,7 μM. Las mutaciones Lys323Ala y Asp320Ala anularon la capacidad de BdorOR13a para unirse al 1-octen-3-ol, lo que en cada caso hizo imposible registrar un valor EC50 (Fig. 5e, f). Además, los resultados del acoplamiento molecular mostraron que las tres mutaciones no podían formar enlaces de hidrógeno con 1-octen-3-ol (Fig. 5-6 complementaria).

una estructura de BdorOR7a-6 predicha usando AlphaFold 2.0. b Residuo de BdorOR7a-6 necesario para unirse a 1-octen-3-ol. c Estructura de BdorOR13a predicha usando AlphaFold 2.0. d Residuos de BdorOR13a necesarios para unirse a 1-octen-3-ol. e Respuesta del mutante BdorOR7a-6 Asn86Ala al 1-octen-3-ol basada en imágenes de calcio. f Respuestas de mutantes BdorOR13a Asp320Ala y Lys323Ala al 1-octen-3-ol basadas en imágenes de calcio.

El principal componente del atrayente comercial ampliamente utilizado para B. dorsalis es el metil eugenol, que atrae fuertemente a los machos pero no a las hembras21. En el campo, la atracción de los machos no tiene ningún efecto beneficioso después del apareamiento porque no evita la oviposición de las hembras grávidas y el daño posterior causado por las larvas. Por lo tanto, el control exitoso de B. dorsalis requiere la interrupción del apareamiento o un atrayente femenino. Las hembras grávidas prefieren poner huevos en frutos maduros de mango7,8,9,10, y se propuso el 1-octen-3-ol como una de las señales olfativas que pueden guiar este comportamiento de oviposición11,12. Descubrimos que el 1-octen-3-ol es más atractivo para las hembras apareadas que para las vírgenes, lo que lo convierte en un candidato ideal para el desarrollo de un atrayente femenino. Curiosamente, cuando se ofrecieron mango y 1-octen-3-ol como opciones alternativas, el 1-octen-3-ol fue la opción preferida y también indujo a las hembras grávidas a poner más huevos. Esto indica que el 1-octen-3-ol no solo atrae a las hembras, sino que también estimula la actividad de oviposición.

Los mutantes BdorOrco-/- no responden al 1-octen-3-ol en los experimentos de EAG y muestran un cambio significativo en el comportamiento de oviposición en nuestro estudio anterior20. Dado que Orco es estrictamente necesario para la percepción de señales olfativas en insectos, el comportamiento de oviposición guiado por 1-octen-3-ol debe estar mediado por OR. Aunque se han realizado varios intentos para identificar los OR para el 1-octen-3-ol, la base molecular de su percepción ha permanecido en gran parte desconocida hasta el momento debido a la falta de una secuencia genómica de alta calidad16. Por lo tanto, anotamos los genes OR de B. dorsalis utilizando un ensamblaje de genoma de alta calidad y varias bases de datos transcriptómicas. Encontramos 74 genes candidatos OR de B. dorsalis, el repositorio más completo hasta el momento, 64 de los cuales clonamos mediante RT-PCR y confirmamos mediante secuenciación de Sanger. Estos datos proporcionan una base sólida para la caracterización funcional de más quirófanos en el futuro. El análisis filogenético de los OR de B. dorsalis y D. melanogaster reveló algunos ortólogos directos pero otros casos de duplicación y divergencia de genes, como se informó anteriormente16, lo que refleja adaptaciones a los olores ambientales, como los volátiles de las plantas. Sería intrigante determinar si estos OR homólogos están involucrados en la percepción de odorantes específicos o conjuntos de odorantes análogos. Los genes OR de B. dorsalis se expresan principalmente en órganos olfativos, como se informó previamente para D. melanogaster22. Aunque se han informado respuestas sexualmente dimórficas a volátiles en B. dorsalis21,23,24, no observamos diferencias transcriptómicas significativas entre machos y hembras, de acuerdo con resultados previos16.

El estado de apareamiento es un interruptor clave para los insectos, lo que les permite entrar en el estado listo para ovipositar que desencadena el comportamiento de oviposición25. Por ejemplo, las hembras apareadas de la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata cambian su preferencia de las feromonas masculinas a los odorantes de frutas hospedantes26. Se predice que el estado de apareamiento de las hembras influirá en su percepción de los volátiles junto con su nuevo estado de comportamiento y necesidades fisiológicas27 y, en consecuencia, encontramos que el 1-octen-3-ol era más atractivo para las hembras apareadas que las vírgenes en el presente estudio. Encontramos 20 genes OR de B. dorsalis que estaban regulados positivamente en hembras apareadas y los consideramos OR candidatos para la percepción de 1-octen-3-ol, pero solo BdorOR7a-6 y BdorOR13a mostraron una respuesta significativa a 1-octen-3. -ol. Los ortólogos de BdorOR13a responden de manera similar al 1-octen-3-ol en D. melanogaster28, Anopheles gambiae29 y Spodoptera frugiperda30.

Los sistemas de expresión heterólogos, incluidos los ovocitos de X. laevis, las células de S. frugiperda (Sf9), las células HEK 293 y el sistema de "neurona vacía" de Drosophila, se han utilizado para identificar ligandos para ORs31 huérfanos. El registro de pinzamiento de voltaje mostró que BdorOR7a-6 tenía un valor EC50 significativamente mayor que BdorOR13a, mientras que las imágenes de calcio no mostraron diferencias significativas entre los receptores. Estos resultados incongruentes pueden reflejar las características inherentes de cada sistema heterólogo y/o diferencias en las técnicas de medición32. Además, los resultados de nuestro registro de abrazadera de voltaje en otro estudio mostraron que BdorOR7a-6 podía responder a los otros dos volátiles, lo que indica que BdorOR7a-6 estaba ampliamente sintonizado para albergar volátiles en comparación con BdorOR13a.

El comportamiento de oviposición inducido por 1-octen-3-ol se alteró significativamente en los mutantes BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/-. Las hembras mutantes grávidas pusieron muchos menos huevos que las moscas WT después de la estimulación con 1-octen-3-ol, y la sensibilidad olfativa reducida al 1-octen-3-ol también interrumpió las huellas de las moscas mutantes. Los videos S1–S4 muestran que las hembras WT localizaron rápidamente el 1-octen-3-ol y luego pusieron huevos a su alrededor, mientras que los mutantes en muchos casos no pudieron localizar el 1-octen-3-ol. Sin embargo, las hembras todavía pusieron significativamente más huevos en el lado tratado con 1-octen-3-ol que en MO. Esto tiene sentido dado que no realizamos los dobles knockouts, por lo que el otro quirófano podría rescatar parcialmente la puesta de huevos. Por lo tanto, BdorOR13a y BdorOR7a-6 parecen estar sintonizados con 1-octen-3-ol, y esto regula el comportamiento de oviposición. Esto es consistente con los hallazgos en el mosquito Culex quinquefasciatus, donde los receptores CquiOR37 y CquiOR99 están estrechamente sintonizados con dos atrayentes de oviposición (4-metilfenol y 4-etilfenol), pero esta preferencia se pierde en los mutantes CquiOR37-/- y CquiOR99-/- 33. Por lo tanto, las respuestas olfativas dependientes de OR son necesarias para el comportamiento de oviposición dirigido por el olor. Los mutantes BdorOR7a-6-/- y BdorOR13a-/- también mostraron una respuesta EAG significativamente más baja al 1-octen-3-ol que las moscas WT, y los mutantes BdorOR13a-/- mostraron la mayor deficiencia. El valor EC50 de BdorOR13a (1,27 µM) también fue mucho más bajo que el de BdorOR7a-6 (105 µM) en el ensayo de fijación de voltaje. Estos datos sugieren que BdorOR13a es el OR primario para la percepción de 1-octen-3-ol, aunque cada receptor puede compensar parcialmente la desactivación del otro.

La mutagénesis dirigida al sitio se puede utilizar para explorar las propiedades de unión de los OR de insectos y los odorantes34,35,36. En este estudio, los mutantes Asp320Ala y Lys323Ala de BdorOR13a no pudieron unirse al 1-octen-3-ol, lo que sugiere que la mutación alteró la conformación del bolsillo de unión. El mutante Asn86Ala de BdorOR7a-6 retuvo su capacidad para unir 1-octen-3-ol pero la afinidad de unión fue mucho menor, lo que indica que la estructura compacta del sitio de unión puede haberse relajado37. Se informaron resultados similares en Ostrinia furnacalis38, D. melanogaster39 y A. gambiae40. Nuestros resultados muestran que la conformación de los OR se ve afectada por el reemplazo de un solo aminoácido, y que los residuos Asp320 y Lys323 de BdorOR13a son requisitos absolutos para la unión de 1-octen-3-ol. El análisis adicional de las estructuras OR puede proporcionar más información sobre los cambios conformacionales involucrados en la unión de los olores, lo que facilita la detección de olores que atraen a B. dorsalis de manera más eficiente al unirse a los OR con mayor afinidad.

En conclusión, encontramos que el 1-octen-3-ol es un fuerte atrayente para las hembras grávidas de B. dorsalis y también regula su comportamiento de oviposición. Completamos la anotación de todo el genoma de los OR de B. dorsalis y utilizamos ensayos de unión in vitro y edición del genoma seguidos de pruebas de comportamiento para mostrar que dos receptores (BdorOR13a y BdorOR7a-6) están sintonizados con 1-octen-3-ol. Nuestros resultados no solo muestran el potencial del 1-octen-3-ol para la atracción de hembras grávidas de B. dorsalis, sino que también revelan la base molecular de su percepción. Esto puede facilitar el desarrollo de atrayentes femeninos más potentes para reducir el impacto de B. dorsalis en los cultivos frutales.

WT B. dorsalis se recolectaron de Haikou, provincia de Hainan, China, en 2008. Se mantuvieron en el Laboratorio Clave de Entomología e Ingeniería de Control de Plagas en Chongqing a 27 ± 1 °C, 70 ± 5% de humedad relativa, con una temperatura de 14- h fotoperíodo. Las moscas adultas se criaron con una dieta artificial que contenía miel, azúcar, levadura en polvo y vitamina C. Las larvas recién nacidas se transfirieron a una dieta artificial que contenía harina de maíz y germen de trigo, levadura en polvo, agar, azúcar, ácido sórbico, ácido linoleico y papel de filtro.

Se establecieron ensayos con señuelos de doble trampa para comparar las preferencias olfativas de hembras grávidas y vírgenes en una jaula transparente de 20 × 20 × 20 cm con orificios distribuidos uniformemente (diámetro = 1,5 mm) en las paredes laterales. Las trampas se reacondicionaron a partir de tubos de centrífuga invertidos de 50 ml y se colocaron a lo largo de la diagonal de la jaula. La parte superior de cada trampa se perforó con una punta de pipeta de 1 ml, que se acortó para garantizar que las moscas pudieran acceder a la trampa desde la pipeta. Para el ensayo de preferencia olfativa con mango, una trampa se cargó con 60 mg de pulpa de mango y la otra trampa con 20 μL MO en la tapa de un tubo PCR de 200 μL. Para el ensayo de preferencia olfativa con 1-octen-3-ol (≥98 %, sigma, EE. UU.), se cargó una trampa con 20 μL de 10 % (v/v) de 1-octen-3-ol diluido en MO, y la otro con 20 μL MO. Se colocó una bola de algodón empapada en agua en el centro de la jaula para proporcionar agua a las moscas. Se introdujeron grupos de 30 moscas hembra en la jaula para cada experimento, y cada experimento se repitió para proporcionar ocho repeticiones biológicas. Todos los experimentos comenzaron a las 10 am para asegurar la consistencia circadiana. El número de moscas en cada trampa se contó cada 2 h durante 24 h. Comparamos las preferencias de hembras inmaduras de 3 días, hembras vírgenes de 15 días y hembras apareadas de 15 días. El índice de preferencia olfativa se calculó mediante la siguiente fórmula41: (número de moscas en mango/trampa odorante – número de moscas en trampa control)/número total de moscas.

El comportamiento de la oviposición fue monitoreado en una jaula transparente de 10 × 10 × 10 cm con orificios distribuidos uniformemente en las paredes laterales como se muestra arriba. Se sirvió una placa de Petri de 9 cm llena con agar al 1% como sustrato de oviposición, y se agregó pulpa de mango, 1-octen-3-ol al 10% (v/v) o MO en los bordes opuestos de la placa. Probamos la preferencia de las moscas por diferentes sustratos: (1) ~60 mg de pulpa de mango en un borde y 20 μL de MO en el otro; (2) 20 μL de 1-octen-3-ol en un borde y 20 μL de MO en el otro; (3) ~60 mg de pulpa de mango en un borde y 20 μL de 1-octen-3-ol en el otro; y (4) ~60 mg de pulpa de mango más 20 μL de 1-octen-3-ol por un lado y ~60 mg de pulpa de mango más 20 μL de MO por el otro. El disco de agar se cubrió con una envoltura de plástico perforada para imitar la piel de la fruta, lo que alentó a las moscas a extender su ovipositor dentro de la envoltura de plástico para poner huevos. El disco de agar se colocó en el centro de la jaula e introdujimos ocho hembras grávidas de 15 días. Dos cámaras Sony FDR-AX40 registraron el comportamiento de las moscas durante 24 h, una colocada encima de la jaula para registrar las huellas y la otra colocada frente a la jaula para registrar el comportamiento de oviposición. Con base en los resultados de los ensayos de atracción con trampas dobles, se seleccionó una duración de 3 h (6–9 h) de los videos para analizar las huellas y el tiempo que pasaron todas las moscas en el área observada (la superficie de la placa de Petri). Los videos se analizaron utilizando EthoVision XT v16 (Noldus Information Technology) para determinar el tiempo total de todas las moscas en cada lado en segundos y la distancia total de movimiento en centímetros, y las huellas se visualizaron en forma de mapas de calor17. El número de huevos puestos por las ocho moscas en cada experimento se contó bajo un estereomicroscopio CNOPTEC, y cada grupo experimental comprendía de 7 a 16 repeticiones.

Las secuencias de aminoácidos de D. melanogaster descargadas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se usaron como consultas BLASTP contra la base de datos de aminoácidos de B. dorsalis con un límite de identidad de 30%. Los genes OR candidatos se compararon con datos transcriptómicos profundos de B. dorsalis antennae42, palpos maxilares y probóscide, y otros tejidos.

Se usó ADN polimerasa PrimerSTAR Max de alta fidelidad (TaKaRa, Dalian, China) para amplificar el marco de lectura abierto completo de los genes BdorOR mediante PCR anidada usando cebadores (Tabla complementaria 2) diseñados de acuerdo con los datos del genoma de B. dorsalis. Cada reacción de 25 μL comprendía 12,5 μL 2 × PrimerSTAR Max Premix (TaKaRa), 10,5 μL de agua ultrapura, 1 μL de cada cebador (10 μM) y 1 μL de la plantilla de ADNc. A un paso inicial de desnaturalización a 98 °C durante 2 min le siguieron 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C y 90 s a 72 °C, y un paso final de extensión de 10 min a 72 °C . Los productos de PCR purificados se transfirieron al vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) para la secuenciación (BGI, Beijing, China).

El ARN total se extrajo de (i) antenas masculinas y femeninas, palpos maxilares, cutícula de la cabeza (sin antena, palpos maxilares y probóscide), probóscide, patas, alas y ovipositores, y (ii) de las cabezas de 15 días de edad. hembras vírgenes y apareadas utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico se eliminó con ADNasa I sin ARNasa (Promega) y la primera cadena de ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARN total utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT (TaKaRa). Se usaron curvas estándar para evaluar la eficiencia del cebador (Tabla complementaria 3) con diluciones en serie cinco veces de ADNc. La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se llevó a cabo utilizando un sistema CFX Connect Real-Time (Bio-Rad, Hercules, CA) en un volumen de reacción total de 10 µL que contenía 5 µL de SYBR Supermix (Novoprotein, Shanghái, China) , 3,9 μL de agua libre de nucleasas, 0,5 μL de ADNc (~200 ng/μL) y 0,3 μL de los cebadores directo e inverso (10 μM). Usamos α-tubulina (GenBank: GU269902) y proteína ribosomal S3 (GenBank: XM_011212815) como genes de referencia internos. Se prepararon cuatro réplicas biológicas para cada experimento. Los niveles de expresión relativa se determinaron mediante el método 2−∆∆Ct43 y los datos se analizaron mediante SPSS v20.0 (IBM).

Los productos de PCR verificados que representan los genes OR candidatos de B. dorsalis y BdorOrco se transfirieron al vector pT7Ts para su expresión en ovocitos. Los plásmidos se linealizaron para la síntesis de cRNA utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (Invitrogen, Lituania). El cRNA purificado se diluyó a 2 µg/µL y se inyectaron ~60 ng de cRNA en ovocitos de X. laevis. Los ovocitos se trataron previamente con 1,5 mg/mL de colagenasa I (GIBCO, Carlsbad, CA) en tampón de lavado (NaCl 96 mM, MgCl2 5 mM, KCl 2 mM, HEPES 5 mM, pH 7,6) durante 30 a 40 min a temperatura ambiente. temperatura antes de la inyección. Después de 2 días de incubación a 18 °C en solución de Ringer (NaCl 96 mM, MgCl2 5 mM, KCl 2 mM, HEPES 5 mM, CaCl2 0,8 mM), los ovocitos se expusieron a diferentes concentraciones de 1-octen-3-ol diluido. en solución de Ringer de un stock de 1 M en DMSO. Las corrientes internas de células enteras inducidas por odorante se registraron a partir de ovocitos inyectados utilizando una abrazadera de voltaje de dos electrodos y un amplificador OC-725C (Warner Instruments, Hamden, CT) a un potencial de retención de -80 mV. La señal se procesó utilizando un filtro de paso bajo a 50 Hz y se digitalizó a 1 kHz. Los ovocitos inyectados con agua libre de nucleasas sirvieron como control negativo. Los datos se adquirieron usando un dispositivo Digidata 1550 A (Warner Instruments, Hamden, CT) y se analizaron usando el software pCLAMP10.5 (Axon Instruments Inc., Union City, CA).

Los productos de PCR verificados que representan los genes OR candidatos de B. dorsalis y BdorOrco se transfirieron al vector pcDNA3.1(+) junto con una etiqueta mCherry que confiere fluorescencia roja para confirmar la transfección. Se preparó ADN de plásmido de alta calidad utilizando el kit Qiagen plasmid MIDIprep (QIAgen, Düsseldorf, Alemania). Los plásmidos B. dorsalis OR y BdorOrco se cotransfectaron en células HEK 293 utilizando el reactivo de transfección TransIT-LT1 (Mirus Bio LLC, Japón) en placas de 96 pocillos. El colorante fluorescente Fluo-4 AM (Invitrogen) se preparó como una reserva de 1 mM en DMSO y se diluyó a 2,5 μM en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Invitrogen, Lituania) para servir como indicador de calcio. El medio de cultivo celular se eliminó 24–30 h después de la transfección y las células se enjuagaron tres veces con HBSS antes de agregar Fluo 4-AM e incubar las células durante 1 h en la oscuridad. Después de tres enjuagues en HBSS, se agregaron 99 μL de HBSS fresco a cada pozo antes de probar en la oscuridad con 1 μL de 1-octen-3-ol diluido. Las imágenes fluorescentes se adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser (Zeiss, Alemania). Fluo 4-AM se excitó a 488 nm y mCherry a 555 nm. El cambio relativo en la fluorescencia (ΔF/F0) se usó para representar el cambio en Ca2+, donde F0 es la fluorescencia de referencia y ΔF es la diferencia entre la fluorescencia máxima inducida por la estimulación con 1-octen-3-ol y la referencia. Las células sanas y transfectadas con éxito (rojas cuando se excitan a 555 nm) se usaron para el análisis. La concentración final de 10−4 M se usó inicialmente para seleccionar los OR correspondientes y luego para determinar la respuesta de los OR seleccionados a la estimulación con diferentes concentraciones de 1-octen-3-ol. Cada concentración de 1-octen-3-ol se ensayó por triplicado. Las curvas de concentración-respuesta se prepararon utilizando GraphPad Prism v8.0 (GraphPad Software).

Las secuencias de exón de BdorOR7a-6 y BdorOR13a se predijeron utilizando el ensamblaje del genoma de B. dorsalis de alta calidad. Cada secuencia de ARNg tenía 20 nucleótidos de longitud más NGG como motivo adyacente protoespaciador (PAM). El potencial de mutaciones fuera del objetivo se evaluó utilizando CasOT para seleccionar la secuencia del genoma de B. dorsalis. Cada ARNg se sintetizó con el kit de síntesis de ARNg de precisión GeneArt (Invitrogen) y se purificó con el kit de limpieza de ARNg GeneArt (Invitrogen). Los embriones se microinyectaron como se describió previamente20. El gRNA purificado y la proteína Cas9 del kit GeneArt Platinum Cas9 Nuclease (Invitrogen) se mezclaron y diluyeron a concentraciones finales de 600 y 500 ng/µL, respectivamente. Los huevos frescos (puestos dentro de los 20 min) se recolectaron y se expusieron a hipoclorito de sodio al 1% durante 90 s para ablandar el corion. Los huevos se fijaron en portaobjetos de vidrio y se les inyectó la mezcla de ARNg y proteína Cas9 en el polo posterior usando un dispositivo IM-300 (Narishige, Tokio, Japón) y agujas preparadas usando un extractor de micropipetas Modelo P-97 (Sutter Instrument Co, Novato, CA). Los huevos se inyectaron con agua libre de nucleasas como control negativo. La inyección se completó en 2 h. Los embriones inyectados se cultivaron en una incubadora a 27 °C y se registró la mortalidad durante el desarrollo posterior.

Los mutantes G0 se seleccionaron como se describió previamente20. Los supervivientes adultos G0 se retrocruzaron individualmente con moscas WT (un solo par) para recoger la descendencia G1. El ADN genómico se extrajo de individuos G0 después de la oviposición utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen). La región que rodea cada objetivo de gRNA se amplificó mediante PCR utilizando el ADN extraído como plantilla, los cebadores específicos enumerados en la Tabla complementaria 2 y 2 × Taq PCR MasterMix (Biomed, Beijing, China). Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis capilar utilizando el kit de alta resolución de ADN QIAxcel (Qiagen). Los productos de PCR que diferían de los alelos WT se purificaron y transfirieron al vector pGEM-T Easy para la secuenciación. Para confirmar que la mutación era hereditaria, también se extrajo ADN genómico de una pata mesotorácica de moscas G1 utilizando InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, CA) y se analizó como se indicó anteriormente. Para evitar posibles mutaciones fuera del objetivo, los mutantes G1 heterocigotos se retrocruzaron con moscas WT más de 10 generaciones antes del autocruzamiento para generar moscas mutantes homocigotas.

Las respuestas antenales de adultos de B. dorsalis de 15 días de edad al 1-octen-3-ol se determinaron mediante registro EAG (Syntech, Países Bajos) como se informó previamente20. Brevemente, las antenas se fijaron a dos electrodos utilizando gel de electrodos Spectra 360 (Parker, Fairfield, NJ, EE. UU.). La respuesta de la señal se amplificó con un dispositivo IDAC4 y se recopiló con el software EAG-2000 (Syntech). Antes de cada experimento, se diluyeron 1-octen-3-ol y otros tres volátiles (tiglato de etilo, acetato de etilo, butirato de etilo) al 10 %, 1 % y 0,1 % (v/v) con MO para servir como estímulo electrofisiológico. y se utilizó MO como control negativo. Se produjo un flujo de aire constante (100 mL/min) usando un controlador (Syntech) para estimular la antena. Luego colocamos 10 µL de cada dilución o MO en un trozo de papel de filtro (5 × 1 cm), y el control negativo (MO) se aplicó antes y después de los odorantes diluidos para calibrar la señal de respuesta. Las respuestas de EAG en cada concentración se registraron para 15 a 20 antenas, y cada concentración se registró dos veces. Cada prueba duró 1 s, y el intervalo entre las pruebas fue de 30 s. Los datos de respuesta de EAG de moscas WT y mutantes para los odorantes diluidos se analizaron mediante la prueba t de Student con SPSS v20.0.

Las estructuras tridimensionales de BdorOR7a-6 y BdorOR13a se modelaron utilizando AlphaFold 2.044. La calidad y racionalidad de cada estructura de proteína se evaluó en línea utilizando un gráfico PROCHECK Ramachandran en SAVES 6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/). Se utilizó AutoDock Vina 1.1.2 para el análisis de acoplamiento, y la estructura de la proteína receptora y la estructura molecular del ligando se trataron previamente con AutoDock 4.2.6. Los parámetros de acoplamiento se establecieron de acuerdo con la estructura de la proteína y los sitios activos, y el modelo de acoplamiento óptimo se seleccionó en función de la afinidad (kcal/mol). Los modelos de acoplamiento se importaron a Pymol y Discovery Studio 2016 Client para el análisis y procesamiento de imágenes. Según los datos de acoplamiento molecular, tres residuos (Asn86 en OR7a-6, Asp320 y Lys323 en OR13a) se reemplazaron con alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio45 utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 2. Ensayos de imágenes de calcio y acoplamiento molecular de proteínas mutadas Luego se llevaron a cabo como se describió anteriormente.

Todos los ensayos de preferencia olfativa, bioensayos de oviposición, análisis de perfiles de expresión, ensayos de registro de EAG se analizaron mediante la prueba t de Student (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001) con SPSS v20.0 (IBM ). Las cifras se generaron utilizando GraphPad v8.0 (GraphPad Software). El tamaño de la muestra de cada ensayo se indicó en el manuscrito.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos finales del genoma del ensamblaje del cromosoma y los datos del transcriptoma para el palpo maxilar y otros tejidos se enviaron a CNGBdb con el número de acceso del ensamblaje CNP0003192, CNP0003333 y CNP0003334, respectivamente. Los datos profundos del transcriptoma para la antena se depositaron en el Centro Nacional para el Archivo de Lectura de Secuencias de Información Biotecnológica (SRA) con los números de acceso SRR9026238.

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Esta investigación fue financiada con fondos del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFC2600100, 2022YFC2601000), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U21A20222, 32072491) y el Sistema de Investigación Agrícola de China (CARS-26) de MOF y MARA.

Estos autores contribuyeron igualmente: Li Xu, Hong-Bo Jiang.

Laboratorio Clave de Entomología e Ingeniería de Control de Plagas, Facultad de Protección Vegetal, Universidad del Suroeste, Chongqing, 400716, China

Li Xu, Hong-Bo Jiang, Jie-Ling Yu, Deng Pan, Yong Tao, Quan Lei, Yang Chen, Zhao Liu y Jin-Jun Wang

Base de cultivo estatal de biología del estrés de cultivos para tierras montañosas del sur, Academia de Ciencias Agrícolas, Universidad del Suroeste, Chongqing, China

Li Xu, Hong-Bo Jiang, Jie-Ling Yu, Deng Pan, Yong Tao, Quan Lei, Yang Chen, Zhao Liu y Jin-Jun Wang

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LX, HJ, ZL y JW diseñaron la investigación; LX, JY y QL realizaron la investigación; LX, DP e YT analizaron los datos; LX, HJ y JW escribieron el artículo; YC crió las moscas mutantes de tipo salvaje y cribadas; Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jin-Jun Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Experimentación con animales: Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de la universidad Southwest. El Xenopus laevis fue anestesiado 30 min por baño en el hielo, las heridas fueron cuidadosamente tratadas para evitar infecciones y minimizar el sufrimiento.

Communications Biology agradece a Dan-Dan Zhang y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Hannes Schuler y Luke R. Grinham.

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Xu, L., Jiang, HB., Yu, JL. et al. Dos receptores odorantes regulan el comportamiento de oviposición inducido por 1-octen-3-ol en la mosca oriental de la fruta. Comun Biol 6, 176 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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Recibido: 28 agosto 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 15 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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