Cruz

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 798 (2023) Citar este artículo

4051 Accesos

56 Altmetric

Detalles de métricas

El virus sincitial respiratorio (RSV), el metapneumovirus humano (HMPV) y el virus de la parainfluenza humana tipo uno (HPIV1) y tres (HPIV3) pueden causar una enfermedad grave y la muerte en pacientes inmunocomprometidos, ancianos y aquellos con enfermedad pulmonar subyacente. Existe un anticuerpo monoclonal protector para RSV, pero el uso clínico está limitado a poblaciones de bebés de alto riesgo. Por lo tanto, las opciones terapéuticas para estos virus en poblaciones de pacientes vulnerables son actualmente limitadas. Aquí, presentamos el descubrimiento, la caracterización in vitro y las pruebas de eficacia in vivo de dos anticuerpos monoclonales de neutralización cruzada, uno dirigido tanto a HPIV3 como a HPIV1 y el otro dirigido tanto a RSV como a HMPV. El anticuerpo 3 × 1 es capaz de atacar múltiples virus de parainfluenza; el anticuerpo MxR comparte características con otros anticuerpos monoclonales informados anteriormente que son capaces de neutralizar tanto RSV como HMPV. Obtuvimos estructuras mediante criomicroscopía electrónica de estos anticuerpos en complejo con sus antígenos a una resolución de 3,62 Å para 3 × 1 unido a HPIV3 y a 2,24 Å para MxR unido a RSV, proporcionando una base estructural para la neutralización y unión in vitro. Juntos, un cóctel de 3 × 1 y MxR podría tener utilidad clínica para brindar una amplia protección contra cuatro de los virus respiratorios que causan una morbilidad y mortalidad significativas en personas en riesgo.

Los virus respiratorios son una de las principales causas de muerte en todo el mundo, con un estimado de 2,7 millones de muertes atribuibles en 20151. Si bien una vacuna para prevenir la infección por RSV puede estar en el horizonte2,3, las vacunas protectoras para HMPV, HPIV3 y HPIV1 aún no están clínicamente disponibles. Incluso si existieran vacunas protectoras para estos cuatro virus respiratorios, la vacunación de individuos altamente inmunocomprometidos rara vez logra una inmunidad protectora. Además, la vacunación antes de las terapias inmunosupresoras a menudo es ineficaz o disminuye rápidamente, y no logra mantener una protección duradera4,5,6. Juntos, RSV, HMPV, HPIV1 y HPIV3 representan una seria amenaza para los pacientes inmunocomprometidos y, antes de la pandemia de COVID-19, eran responsables de la mayoría de las infecciones virales de las vías respiratorias inferiores en los receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas7,8. En adultos con otros factores de riesgo, la carga de enfermedad del HMPV y los virus parainfluenza también es comparable a RSV9,10. Además, con la excepción de los rinovirus, los virus RSV, HMPV y parainfluenza también representan colectivamente la mayoría de los virus respiratorios identificados en adultos hospitalizados antes de 202011,12.

Si bien las estrategias de mitigación durante la pandemia de COVID-19, como el uso de máscaras, el distanciamiento social y los cierres, llevaron a una disminución en los casos de otros virus respiratorios durante las temporadas de resfrío y gripe 2020-2021, los casos de RSV, HMPV y HPIV están comenzando a disminuir. vuelven a aumentar y se espera que vuelvan a los niveles de circulación previos a la pandemia en los próximos años9,10. De hecho, los modelos proyectan grandes brotes futuros de virus respiratorios distintos del SARS-CoV-2 debido a un aumento en el tamaño de la población susceptible luego de un período de propagación reducida13. Además, dado que los virus respiratorios endémicos tienden a circular estacionalmente, pueden ocurrir coinfecciones con más de un virus respiratorio y se han asociado con peores resultados en poblaciones vulnerables14,15,16.

La administración de anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb) proporciona una alternativa eficaz a la vacunación para proteger contra las infecciones virales. Aunque el palivizumab anti-RSV mAb recibió la aprobación de la FDA en 1998 como profilaxis en lactantes de alto riesgo17, sigue siendo relativamente poco utilizado en niños mayores inmunocomprometidos o adultos. Desde la aprobación de palivizumab, los mAbs aún más potentes contra el RSV han progresado a través de ensayos clínicos, con el objetivo principal de reemplazar a palivizumab como el estándar de atención para la profilaxis en bebés de alto riesgo. Este enfoque ha sido impulsado en parte porque el RSV causa hasta el 80 % de la bronquiolitis en los bebés18,19. Sin embargo, en adultos inmunocomprometidos, el panorama de virus respiratorios es mucho más heterogéneo7,8. Por lo tanto, una estrategia eficaz para reducir la carga general de la amplia gama de infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos en riesgo y pacientes inmunocomprometidos debe basarse en atacar múltiples virus simultáneamente, en lugar de un solo virus. A pesar de los avances en la investigación sobre la prevención del RSV, el papel de la inmunización pasiva para otros virus respiratorios sigue estando mal definido y actualmente no hay mAbs disponibles en la clínica que puedan prevenir la infección por HMPV, HPIV1 o HPIV3.

Para lograr de manera eficiente una protección más amplia contra estos virus, buscamos identificar mAbs de neutralización cruzada que pudieran atacar a más de un virus a la vez. RSV, HMPV, HPIV3 y HPIV1 producen proteínas de fusión de clase I (F) que son glicoproteínas de superficie esenciales especializadas para mediar la fusión entre las membranas viral y de la célula huésped durante la entrada viral. HPIV1 y HPIV3 pertenecen al mismo género Respirovirus y sus secuencias F comparten una homología de secuencia de aminoácidos del 65 %. RSV y HMPV pertenecen a la misma familia Pneumoviridae, y sus secuencias F comparten ~54% de homología. Las proteínas F hacen la transición entre una conformación de prefusión metaestable (preF) y una conformación de posfusión estable (postF)20,21. Dado que preF es la conformación principal de los viriones infecciosos, los anticuerpos contra preF tienden a ser los más potentes para neutralizar el virus22,23,24,25. Al igual que RSV, las proteínas HPIV3 y HPIV1 F en la conformación de prefusión provocan títulos de anticuerpos neutralizantes más altos en comparación con la conformación de posfusión26. En un estudio anterior, utilizamos la proteína preF HPIV3 estabilizada para identificar y caracterizar varios anticuerpos neutralizantes contra HPIV327. Para HMPV, aunque los anticuerpos dirigidos a la conformación posterior a la fusión también contribuyen a neutralizar los títulos de anticuerpos28, la F de posfusión de HMPV no provoca anticuerpos de neutralización cruzada contra RSV29. En el presente estudio, aprovechamos la homología entre las proteínas F relacionadas y nos enfocamos en sus conformaciones preF para identificar y clonar dos potentes mAbs de neutralización cruzada, 3 × 1 y MxR, de células B de memoria humana. 3 × 1 neutraliza de forma cruzada tanto HPIV3 como HPIV1, mientras que MxR neutraliza de forma cruzada tanto HMPV como RSV. Juntos, 3 × 1 y MxR comprenden un cóctel de anticuerpos con la capacidad de lograr una protección simultánea contra múltiples virus que podría ser beneficioso para las poblaciones en riesgo que se encuentran en una desventaja inmunológica significativa cuando se infectan con virus respiratorios.

Dado que prácticamente todos los seres humanos han estado expuestos a RSV, HMPV, HPIV3 y HPIV130, no fue necesario realizar una evaluación previa de la seropositividad de los donantes. Debido a que hay una falta de mAbs actualmente en desarrollo contra los virus de la parainfluenza, primero enfocamos nuestros esfuerzos en la detección de células B de neutralización cruzada HPIV3/HPIV1. Dado que no pudimos producir la proteína F de HPIV1 en la conformación preF, para realizar esta pantalla usamos la proteína F de HPIV3 sola aprovechando una estrategia de cebo y cambio (Fig. 1a, b). Aquí, las células B que se unen a HPIV3 se aislaron mediante la incubación de 200 millones de esplenocitos humanos con tetrámeros de HPIV3 preF conjugado con aloficocianina (APC) y tetrámeros de HPIV3 postF conjugado con APC/Dylight755 seguido de enriquecimiento magnético con microesferas anti-APC. Novecientas células B que unían tetrámeros preF de HPIV3 pero no tetrámeros postF se clasificaron individualmente en pocillos que contenían células alimentadoras 3T3 productoras de CD40L/IL2/IL21 y luego se incubaron durante 13 días para estimular la secreción de anticuerpos en los sobrenadantes del cultivo. Para identificar los pocillos que contenían células B candidatas que expresaban anticuerpos de neutralización cruzada, los sobrenadantes de cultivo de las células B que se unen a HPIV3 clasificadas individualmente se mezclaron con el virus HPIV1 vivo y se examinó su capacidad para reducir la formación de placa (Fig. 1a, c). Dos de las 900 células B que se unen a HPIV3 produjeron anticuerpos que podrían neutralizar HPIV1 (Fig. 1c). A partir de estas células, los genes de la cadena pesada (VH3-23) y ligera (Vλ3-19) expresados ​​se secuenciaron y clonaron con éxito para producir un mAb con capacidad de neutralización cruzada contra HPIV3/HPIV1 que llamamos 3 × 1 (Fig. 1b, C). Se aisló 3 × 1 de una célula B que expresaba el isotipo IgA. Dado que palivizumab y la mayoría de los otros mAbs que se están desarrollando contra los virus respiratorios utilizan una región constante de IgG1, 3 × 1 también se clonó y produjo para estudios posteriores como IgG1.

un enfoque de cebo y cambio que utiliza un solo antígeno para identificar las células B que neutralizan de forma cruzada a otro virus relacionado. Se marcaron células B de unión a HPIV3 de bazo humano con tetrámeros de HPIV3 preF conjugados con APC. b Gráfica de citometría de flujo de células B de unión a preF de HPIV3 después de la selección de células B vivas, CD3−CD14−CD16−CD19+CD20+ (células B), IgD−/IgM− (cambio de isotipo) y APC/Dylight755− HPIV3 postF− ( para excluir las células que se unen a HPIV3 postF, APC o estreptavidina). La fracción unida contiene células enriquecidas magnéticamente utilizando microesferas específicas de APC. Los números en las parcelas son porcentajes del total de celdas en la puerta. El cuadro rojo indica la célula B de la que se derivó 3 × 1 mAb. c Distribución de frecuencia de placas de HPIV1 por pozo de la pantalla de neutralización. La línea de puntos indica el número medio de placas en pocillos de control negativo que contienen el virus en ausencia de anticuerpos. La barra roja incluye datos del pozo que contenía la célula B productora de 3 × 1. d La cinética de unión de 3 × 1 IgG (arriba) y Fab (abajo) a HPIV3 preF se midió mediante interferometría de biocapa (BLI) para determinar las afinidades aparentes (KD). La asociación con 3 × 1 a la sonda precargada de HPIV3 se midió durante 300 s seguida de la disociación durante 1200 s. Las mediciones se normalizan frente a un anticuerpo de control de isotipo. e Las células Vero se infectaron con HPIV3 o HPIV1 en presencia de diluciones en serie de palivizumab o 3 × 1. La línea media punteada indica PRNT60. Los puntos de datos son el promedio ± SD de tres experimentos independientes. Panel (a) creado con BioRender.com.

Aunque no teníamos la proteína F de HPIV1 estabilizada en la conformación preF, estimamos la afinidad de unión aparente entre 3 × 1 y la proteína F de HPIV3 en la conformación preF. Como IgG, 3 × 1 se unió fuertemente a la proteína preF de HPIV3 (KD <10−12 M) (Fig. 1d). La afinidad de unión de 3 × 1 Fab fue menor (KD = 1,9 × 10−7 M), debido a la rápida disociación, lo que indica que es probable que se requiera la unión simultánea de ambos Fab para mantener la unión (Fig. 1d). La potencia neutralizante de 3 × 1 se determinó mediante una prueba de neutralización por reducción de placa del 60% (PRNT60) usando virus vivo para infectar células Vero. 3 × 1 tenía una potencia de neutralización igualmente alta contra HPIV1 y HPIV3, con un PRNT60 de 352 y 242 ng/mL, respectivamente (Fig. 1e). La investigación adicional reveló que 3 × 1 bloqueó la propagación de célula a célula y la formación de sincitios por HPIV3 en cultivo celular (Fig. S1). Estos resultados sugieren que el epítopo de 3 × 1 podría conservarse funcionalmente entre HPIV3 y HPIV1.

Dado que el panorama antigénico de HPIV3 preF no está bien caracterizado, primero realizamos experimentos de unión de competencia cruzada para medir los sitios antigénicos en HPIV3 preF que permiten la neutralización. El epítopo para el mAb de neutralización cruzada 3 × 1 no parecía superponerse con los epítopos de los mAb que habíamos aislado previamente que se unen al vértice de preF y HPIV3 neutralizado (Fig. 2a)27. Sin embargo, el epítopo de 3 × 1 parecía superponerse con el epítopo de un anticuerpo PI3-A12 descrito anteriormente, que se une a un sitio antigénico que llamamos sitio X27. Para determinar cómo interactúa 3 × 1 con el sitio X, utilizamos cryo-EM. Muchas partículas de trímero preF de HPIV3 tenían <3 Fab unidos, a pesar de que el Fab estaba en exceso molar de trímero durante la preparación de la muestra (Fig. S3a). Obtuvimos una estructura de 1 Fab en complejo con HPIV3 resuelto a 3.62 Å (Fig. S2a y Tabla S1). También obtuvimos una estructura de 3 Fab unidos a HPIV3; este mapa se limitó a una resolución de 4,3 Å (Figs. S2a y S3a). No notamos ninguna variación significativa entre el protómero preF unido y el protómero preF no unido (RMSD = 0,721 sobre 360 ​​Cα) en la estructura C1. En consecuencia, utilizamos la estructura de mayor resolución para la construcción del modelo. 3 × 1 se une al dominio III de HPIV3 preF, sobresale perpendicularmente y se une solo a un protómero, sin contactos adicionales con otras regiones (Fig. 2b). Solo cuatro de las seis CDR están involucradas en la unión, siendo CDRH1 y CRDL2 demasiado cortas para contactar con la superficie de la glicoproteína (Fig. 2c, d). 3 × 1 se une al sitio X con un área de superficie enterrada total (BSA) de ~ 812 Å 2, de los cuales el VH contribuye con ~ 612 Å 2 y el VL contribuye con ~ 200 Å 2 (Fig. 2b, c). La comparación con la estructura PI3-A12:HPIV3 indicó que 3 × 1 se une al mismo sitio pero se gira en relación con HPIV3 preF (Fig. S3b). Mientras que 3 × 1 neutraliza tanto HPIV3 como HPIV1, PI3-A12 neutraliza solo HPIV327 y 3 × 1 comparte poca similitud de secuencia CDR con PI3-A12 (Fig. S3c). Debido a la falta de una estructura de alta resolución para el complejo PI3-A12:HPIV3, no pudimos determinar si el 3 × 1 LC se superpone con el PI3-A12 LC o HC. Por lo tanto, 3 × 1 y PI3-A12 pueden unirse a epítopos distintos dentro del mismo sitio de HPIV3 preF, ya que muestran una variación de secuencia significativa en residuos clave en 3 × 1 que facilitan la unión (Fig. S3c).

una medida de BLI de la capacidad del mAb enumerado en el lado izquierdo del gráfico para evitar la unión del mAb enumerado en la parte superior, expresada como el porcentaje de caída en la señal máxima en comparación con la señal máxima en ausencia de mAb competitivo. b Estructura Cryo-EM de 3 × 1 Fab en complejo con HPIV3 preF. A la izquierda, se muestra una vista de arriba hacia abajo del mapa 3 × 1:HPIV3 con un Fab (VH en púrpura, VL en rosa) y HPIV3 preF en tonos de gris. A la derecha, se muestra una representación superficial del complejo girada 90° con el dominio III en azul claro y el dominio II en amarillo en un protómero. Los glicanos se muestran como esferas verdes. c Gráficas de BSA para cada residuo Fab que interactúa con el protómero preF, encima de una alineación de secuencia con la línea germinal VH y VL para 3 × 1. d Vista detallada del sitio de unión 3 × 1 con solo las CDR que interactúan que se muestran en la caricatura, rotadas 60 ° del panel (b). Los recuadros muestran las ubicaciones de los paneles (e) y (f). e Vista ampliada del sitio de unión de CDRH3 rotado 40° desde el panel (b). f Vista ampliada del sitio de unión de CDRL3 rotado 110° desde el panel (b). e, f Los residuos de CDR que no hacen contacto con HPIV3 preF se han ocultado a la vista para mayor claridad.

Un análisis adicional de la resolución local de nuestro mapa indicó que el sitio de unión tenía una resolución más alta de ~ 3.0 Å en comparación con la resolución general de 3.62 Å (Fig. S1a). Los 3 × 1 VH y VL juntos unen específicamente la hendidura entre la hélice HRA y un motivo hoja-vuelta-hoja, una región contigua corta de HPIV3 (Figs. S4a-d y S5a, b). Esta región es crucial para el reordenamiento preF a postF, con la hélice HRA y el motivo hoja-vuelta-hoja mostrando >9 Å de movimiento durante el reordenamiento26. El HRA también puede desempeñar un papel en la neutralización de HPIV1, ya que es probable que 3 × 1 interactúe con el HRA en HPIV1 (Fig. S4e). Debido al importante movimiento requerido de este sitio durante la fusión, y su potencia como epítopo neutralizante para RSV preF31, la unión de 3 × 1 en esta ubicación presenta una sólida base estructural para la alta potencia neutralizante de 3 × 1. El CDRH2 y el CDRH3 de 3 × 1 forman varias protuberancias en ranuras en la superficie de HPIV3 preF utilizando residuos no polares (Fig. 2d, e). His52AHC y Phe56HC (CDRH2) junto con Leu100BHC y Leu100FHC (CDRH3) representan ~55 % del VH BSA total (Fig. 2c). La mayoría de los demás residuos de contacto dentro del VH son residuos polares que forman contactos con generalmente <50 Å2 de BSA. Los residuos de VL de 3 × 1 forman contactos con HPIV3 preF usando grupos funcionales polares y la columna vertebral del bucle CDR, con CDRL1 que abarca una gran protuberancia en HPIV3 preF (Fig. 2c, f). Esta extensión de CDRL1 está respaldada por Arg91LC, que se pone en contacto con Tyr31LC y Leu100FHC, con Arg91LC formando un enlace con Asp143 de HPIV3 preF, que se conserva en HPIV1 (Figs. S5a-c y S6a). También notamos una característica mal resuelta en nuestro mapa 3 × 1: HPIV3, que puede ser el extremo C de la proteína F2 después de la escisión de furina (Fig. S7a, b). Si bien no hay suficiente densidad para construir esta región, su proximidad al sitio de unión 3 × 1 podría indicar un epítopo de unión adicional.

Dado que RSV y HMPV también contribuyen significativamente a la enfermedad en pacientes vulnerables, a continuación buscamos identificar posibles mAbs de neutralización cruzada de HMPV/RSV que podrían combinarse con 3 × 1 para crear un cóctel potente con amplitud ampliada. Aunque muchos mAbs dirigidos a RSV y HMPV ya están en desarrollo, utilizamos nuestro enfoque aprovechando sondas tetraméricas fluorescentes para identificar células B únicas capaces de unirse a proteínas F recombinantes de RSV y HMPV en la conformación preF, pero no en la postF. RSV preF conjugado con APC, HMPV preF conjugado con R-ficoeritrina (PE), RSV postF conjugado con APC/DyLight755 y HMPV postF conjugado con PE/DyLight650 se mezclaron con 200 millones de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes del enriquecimiento magnético con microesferas anti-PE y anti-APC. Luego, clasificamos las células B con cambio de isotipo único que se unen a las proteínas F de RSV y HMPV en la conformación preF pero no en la conformación postF, seguido de la secuenciación de células individuales y la clonación de sus receptores de células B (Fig. 3a). Usando este método, los alelos de cadena pesada (VH3-21) y ligera (Vλ1-40) de una célula B capaz de unirse tanto a RSV como a HMPV se secuenciaron y clonaron como un mAb que llamamos MxR (Fig. 3b). Esta célula B expresó el isotipo IgG. Al igual que 3 × 1, MxR se clonó y produjo como IgG1 para su posterior estudio.

Se marcaron células B de sangre humana que se unen a RSV y HMPV con tetrámeros de estreptavidina conjugados con APC de proteína de prefusión de RSV biotinilada (preF) y tetrámeros de estreptavidina conjugados con PE de preF de HMPV biotinilado. b Gráfica de citometría de flujo de células B que se unen a preF de RSV y HMPV después de seleccionar para vivo, CD3-CD14-CD16- CD19+CD20+ (células B), IgD-/IgM- (con cambio de isotipo) y APC/Dylight755- HMPV postF − y PE/Dylight650−RSV postF− (para excluir las células que se unen a RSV/HMPV postF, APC, PE o estreptavidina). La fracción unida contiene células enriquecidas magnéticamente utilizando microesferas específicas de APC y PE. Los números en las parcelas son porcentajes del total de celdas en la puerta. El cuadro rojo indica la célula B de la que se derivó MxR mAb. c Afinidad aparente (KD) de MxR, MPE8 y D25 medida por BLI. d Se infectaron células Vero con RSV-A, RSV-B o HMPV en presencia de diluciones en serie de palivizumab (Pali.), D25, MPE8 o MxR. Los puntos de datos representan el título de neutralización de reducción de placa del 60 % y proceden de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican p < 0,05 usando una prueba t de dos colas con la corrección de Welch. Los números junto a los asteriscos indican el valor p exacto. Panel (a) creado con BioRender.com.

Comparamos la afinidad de unión aparente de MxR con el anticuerpo monoclonal D25 específico del RSV, que se está desarrollando con el nombre de nirsevimab para la profilaxis del RSV en lactantes32,33. RSV tiene dos subtipos antigénicamente distintos, A y B, que comparten una homología de secuencia de aminoácidos del 91% dentro de la proteína F. MxR se unió irreversiblemente con una alta afinidad aparente a las proteínas preF de los subtipos A y B de RSV (KD < 10−12 M cada uno), incluso cuando el tiempo de disociación se extendió a 1200 s (Figs. 3c y S8a, d). El anticuerpo monoclonal de neutralización cruzada MPE834 informado anteriormente también exhibió una alta afinidad aparente por los subtipos A y B del RSV (Figs. 3c y S8b, e). D25 también se unió fuertemente a la proteína preF del subtipo B de RSV, pero con una afinidad aparente ~ 1500 veces menor (KD = 1.5 × 10−9 M) en comparación con su unión al subtipo A (Figs. 3c y S8c, f). MxR también podría unirse a la proteína preF de HMPV (Figs. 3c y S8g), lo que se esperaba dada la selección deliberada de células B que se unen tanto a RSV como a HMPV durante la clasificación. En comparación con MPE8, la afinidad de unión aparente de MxR por HMPV fue aproximadamente 1,6 veces más fuerte (Figs. 3c y S8g, h).

Dado que ambos subtipos de RSV circulan en todo el mundo, era importante evaluar la potencia de neutralización (PRNT60) de MxR para los subtipos A y B. También comparamos la potencia de neutralización de MxR con el anticuerpo monoclonal específico de RSV palivizumab, que actualmente está aprobado para RSV profilaxis en lactantes de alto riesgo. Descubrimos que MxR neutralizó el subtipo A del RSV con una potencia al menos 6 veces mayor en comparación con palivizumab (Figs. 3d y S9a). A diferencia de palivizumab, que tiene una potencia similar contra ambos subtipos35, MxR también fue muy potente contra el subtipo B, con una potencia 12 veces mayor (Figs. 3d y S9b). Aunque D25 tenía una mayor potencia neutralizadora contra RSV-A (Fig. 3d), se informa que D25 tiene una potencia más débil contra algunas cepas de RSV-B y no neutraliza HMPV36,37,38. MxR y MPE8 tenían una potencia similar para neutralizar los subtipos A y B del RSV. Sin embargo, MxR tenía una potencia al menos 5 veces mayor contra el HMPV, con un PRNT60 de 148 ng/mL en comparación con 838 ng/mL para MPE8 (Figs. 3d y S8c). Según la concentración de anticuerpo necesaria para neutralizar el 60 % del virus vivo, la potencia de MxR contra HMPV superó la potencia relativa de palivizumab contra RSV (Fig. 3d).

Para comprender mejor la base de la neutralización cruzada observada con MxR, obtuvimos una estructura crio-EM de tres MxR Fab unidos a RSV preF con una resolución de 2.24 Å (Figs. S2b, S10 y Tabla S1). MxR se une principalmente al sitio antigénico III en RSV con una disposición ecuatorial de Fabs alrededor de RSV preF. El sitio antigénico III es un epítopo cuaternario en la unión de los dominios I y III de un protómero F y el dominio II del protómero F adyacente en el sentido de las agujas del reloj (denominado II') (Fig. 4a). MxR se une con una BSA total de ~1094 Å2, con VH contribuyendo con ~694 Å2 y VL contribuyendo con ~400 Å2, de los cuales ~298 Å2 contactan con el protómero F principal y ~102 Å2 contactan con el protómero F adyacente. Nuestra estructura reveló numerosas moléculas de agua espaciadas a lo largo del sitio de unión que potencialmente median en las interacciones entre el protómero Fab y preF (Fig. S11). Estos fueron omitidos de la Fig. 4 para mayor claridad. El modo de unión es casi idéntico al del anticuerpo monoclonal de neutralización cruzada MPE834 y al anticuerpo monoclonal infantil ADI-1942539, que se derivan de la misma cadena germinal pesada (IGHV3-21*01) y ligera (IGLV1-40*01). ) alelos. La comparación de la BSA por residuo de RSV preF en complejo con MxR, MPE8 y ADI-19425 reveló regiones de unión comunes que comparten una alta homología de secuencia con HMPV (Fig. S6b). La secuencia y la estructura de CDR1 y CDR2 son casi idénticas en los tres anticuerpos, y MxR en general tiene más mutaciones de la línea germinal que los otros dos (Fig. 4b, c).

a Izquierda, se muestra una vista de arriba hacia abajo del mapa crio-EM DeepEMhanced MxR:RSV, con MxR VH en rojo oscuro, MxR VL en rojo claro y RSV preF en tonos de gris. Solo se muestra el dominio Fv del Fab. A la derecha, se muestra una representación superficial de la estructura girada 90°. Un protómero preF está coloreado por sus dominios estructurales, y un MxR Fv se muestra en un contorno de dibujos animados. El dominio DII del protómero adyacente en el sentido de las agujas del reloj está en rosa claro y se designa como DII' para diferenciarlo del DII del otro protómero, coloreado en violeta. Los glicanos se muestran como esferas verdes. ( b ) Gráficos de BSA para residuos MxR, MPE8 y ADI-19425 que interactúan con RSV preF, encima de una alineación de secuencia de los genes V de la línea germinal. La letra H indica enlaces de hidrógeno. La letra S indica puentes salinos. Los residuos en recuadros de colores corresponden a los residuos que se muestran en los paneles (d y e). c Vista detallada del sitio de unión en RSV preF con las CDR de MxR, MPE8 y ADI-19425 superpuestas y mostradas en la caricatura. MPE8, en verde, y ADI-19425, en azul, se muestran en transparencia. El sitio antigénico III está delimitado por el contorno blanco. d Vista ampliada del sitio de unión de CDRH3 girado 30° en sentido contrario a las agujas del reloj desde el panel (c). e Vista ampliada del sitio de unión de CDRL3, girada 65° en el sentido de las agujas del reloj desde el panel (c). Los primeros cuatro residuos se muestran como cadena principal solo para aumentar la claridad e ilustrar la similitud de CDRL3 entre anticuerpos.

Las regiones CDRH3 de MxR, MPE8 y ADI-19425 tienen un mayor grado de secuencia y variación estructural, casi sin residuos conservados, a pesar de que todos se unen cerca de la interfaz DI/DII'/DIII dentro del sitio antigénico III. Hay una pequeña hendidura en esta interfaz, en la que los bucles CDRH3 se extienden en diversos grados (Fig. 4c, d). MPE8 CDRH3 es el más largo, mientras que MxR es el más corto y ADI-19425 es de longitud intermedia. En particular, ADI-19425 usa un enlace disulfuro para estabilizar este bucle, mientras que MPE8 y MxR carecen de este enlace (Fig. 4d)34,39. La geometría rígida impuesta por el enlace disulfuro puede afectar la capacidad de ADI-19425 para unirse al HMPV. La necesidad de MPE8 CDRH3 para formar la geometría de bucle correcta para unirse dentro de la hendidura del sitio antigénico III puede ser una base estructural detrás de la neutralización reducida de MPE8 de HMPV en comparación con MxR (Figs. 4c, d y 3d). Debido a un CDRH3 relativamente más corto que MPE8, MxR se une en esta hendidura sin ponerse en contacto con DII' y, por lo tanto, no requiere un bucle extendido para facilitar la unión (Figs. 4d y S6b). Solo el CDRL2 de MxR contacta con DII' (Fig. 4c). Cuando las CDR se superponen al protómero de HMPV, encontramos que el sitio de unión general es muy similar y comprende contribuciones de sitios antigénicos e identidades de residuos similares (Fig. S12a, b). Sin embargo, la hendidura de unión disponible es más estrecha y más corta, lo que puede obstaculizar estéricamente los bucles ADI-19425 y MPE8 CDRH3 (Fig. S12c). Los CDRL3 también muestran alguna variación en los residuos que interactúan (Fig. 4e). Tanto MPE8 como MxR comparten un residuo básico en la posición 93LC que no se comparte con ADI-19425, y los tres anticuerpos exhiben arreglos de bucle ligeramente diferentes en los residuos 94–96LC (Fig. 4e). Sin embargo, los modos de unión de los CDRL3 parecen similares, sin las características únicas que se ven en los CDRH3.

A continuación, investigamos si los datos de unión y neutralización in vitro se traducirían en protección in vivo en un modelo de desafío animal. Aunque los virus de la parainfluenza humana no se replican en ratones, se puede demostrar la replicación en el tracto respiratorio superior e inferior tanto en hámsters como en ratas algodoneras30,40. Para RSV, se han informado títulos virales comparables en los pulmones de hámsteres y ratas algodoneras41. Aunque algunos estudios han observado títulos más altos de HMPV en los pulmones de ratas algodoneras en comparación con los hámsters42,43, esto podría estar relacionado con las diferencias en la cepa viral utilizada, el tamaño del inóculo y el momento de la toma de muestras de los pulmones. El modelo de hámster se ha utilizado ampliamente para evaluar vacunas candidatas para virus de parainfluenza, RSV y HMPV44,45,46,47,48,49,50,51,52. Dado que todos los virus en este estudio podrían replicarse en hámsters44,45,51,53,54,55,56,57, realizamos pruebas preclínicas de MxR y 3 × 1 en el modelo de hámster dorado sirio. Realizamos inyecciones intramusculares en hámsteres el día -2, infectamos los hámsteres por vía intranasal el día 0 y recolectamos pulmones y cornetes nasales el día 5 después de la infección para evaluar la eficacia de los anticuerpos monoclonales como profilaxis contra la infección (Fig. 5a). Esta dosificación, vía y tiempo de administración son similares a los utilizados en modelos de ratas algodoneras de infección por RSV41,58,59. Realizamos experimentos de búsqueda de dosis con 3 × 1 contra HPIV3 y MxR contra RSV, usando palivizumab como punto de referencia. Dos días después de la inyección intramuscular de la dosis de 5 mg/kg en hámsters, observamos concentraciones séricas de mAb de 5,1–9,7 µg/mL (Fig. 5b). A una dosis de 5 mg/kg, MxR y 3 × 1 suprimieron por completo la replicación viral de HPIV3 y RSV, respectivamente, en los pulmones (Fig. 5c, d). Por el contrario, palivizumab a 5 mg/kg no suprimió por completo la replicación viral en los pulmones, aunque palivizumab y MxR tenían una EC90 similar contra RSV (Fig. 5d, e). Esto es coherente con los datos del modelo de rata algodonera en el que también se observó una infección progresiva con palivizumab a 5 mg/kg60. La administración profiláctica de 3 × 1 a 5 mg/kg tuvo poco impacto en la replicación en los cornetes nasales (Fig. 5c). Sin embargo, la administración profiláctica de MxR a 5 mg/kg redujo la replicación del RSV en los cornetes nasales en más de 47 veces (Fig. 5d). Esto contrasta con palivizumab, que no tuvo ningún efecto sobre la replicación del RSV en los cornetes nasales. Dado que la dosis de 5 mg/kg suprimió la replicación viral de RSV y HPIV3, también analizamos esta dosis para HPIV1 y HMPV. La replicación de HPIV1 se bloqueó por completo en los pulmones de todos los animales menos uno y se redujo significativamente en los cornetes nasales de los hámsteres que recibieron profilaxis 3 × 1 (Fig. 5f). La replicación de HMPV se redujo significativamente en más de 206 veces en los pulmones de los hámsteres que recibieron profilaxis con MxR (Fig. 5g).

a Esquema de experimentos en los que se inyectaron hámsters por vía intramuscular con 3 × 1 o MxR dos días antes de la exposición intranasal con 105 ufp de virus. b Las concentraciones séricas de 3 × 1 y MxR dos días después de la administración de mAb a 5, 2,5 y 1,25 mg/kg se midieron mediante ELISA (n = 4 animales/dosis). Dosis-respuesta de 3 × 1 (c) y MxR (d) en la replicación de HPIV3 y RSV, respectivamente (n = 5 animales de experimentación/dosis/virus, n = 5 cornetes nasales de animales de control/virus, y n = 4 pulmones de animales de control /virus). e Concentración efectiva del 90 % (EC90) de palivizumab contra RSV, MxR contra RSV y 3 × 1 contra HPIV3 según experimentos de dosis-respuesta. f HPIV1 y (g) replicación de HMPV después de la inyección con 3 × 1 o MxR a 5 mg/kg, respectivamente (n = 8 animales/grupo en dos experimentos independientes para HPIV1; y n = 10 cornetes nasales de animales/grupo, n = 10 pulmones de animales experimentales, y n = 7 pulmones de animales de control en dos experimentos independientes para HMPV). Los títulos virales se midieron mediante ensayo de placa en homogeneizados pulmonares y nasales de hámsteres individuales a los 5 días después de la infección. Las líneas discontinuas indican el límite de detección. Las barras representan la media y los asteriscos indican una p < 0,05 bilateral según la prueba de Mann-Whitney en comparación con los hámsteres de control inyectados con 1x DPBS. Los números junto a los asteriscos indican el valor p exacto. Panel (a) creado con BioRender.com.

Si se administran juntos como un cóctel, MxR y 3 × 1 podrían brindar una amplia protección contra HMPV, RSV, HPIV3 y HPIV1. Esto es clínicamente relevante porque los cuatro virus juntos representan la mayoría de las infecciones virales respiratorias graves en los receptores de trasplantes de células madre hematopoyéticas. En comparación con la administración conjunta de cuatro mAb (uno por virus), el uso de dos mAb para atacar cuatro virus permite la administración de una dosis más alta de cada mAb, lo que podría maximizar la eficacia y minimizar la toxicidad. La administración de un cóctel también podría ser útil en caso de coinfecciones con múltiples virus respiratorios, ya que las coinfecciones pueden asociarse con peores resultados en pacientes inmunocomprometidos16. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de coinfección HPIV3/RSV en hámsters para evaluar la eficacia cuando MxR y 3 × 1 se administran juntos. Dado que el ensayo de placas para determinar los títulos virales no pudo distinguir entre HPIV3 y RSV, desarrollamos sondas TaqMan personalizadas para cuantificar las cargas virales individuales mediante PCR en tiempo real. Primero, comparamos los niveles de HPIV3 y RSV detectados en los pulmones de animales infectados con uno o ambos de estos virus. De manera similar a los datos de estudios en humanos que sugieren que las coinfecciones entre RSV y otros virus no tienen un impacto en los títulos de RSV61, no observamos ninguna disminución en la replicación viral en los pulmones de animales inoculados simultáneamente con cantidades iguales de RSV y HPIV3, en comparación a animales inoculados con un solo virus (Fig. 6a, b).

La carga viral específica de HPIV3 (a) y RSV (b) en homogeneizados de pulmón de hámsters coinfectados con 105 ufp de cada uno de RSV y HPIV3 se comparó con hámsteres infectados con 105 ufp de un solo virus mediante PCR en tiempo real: n = 4 animales/infección única y n = 6 para la coinfección. c Esquema de experimentos en los que a los hámsters se les inyectaron por vía intramuscular 5 mg/kg cada uno de 3 × 1 y MxR como un cóctel dos días antes de la exposición intranasal con 105 ufp de cada uno de HPIV3 y RSV. La carga viral específica de HPIV3 (d) y RSV (e) en homogeneizados de tejido pulmonar y nasal se determinó mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos de HPIV3 y RSV, respectivamente. Para HPIV3: n = 8 cornetes nasales de animales/grupo, n = 8 pulmones de animales experimentales y n = 7 pulmones de animales de control en dos experimentos independientes. Para RSV: n = 7 animales/grupo en dos experimentos independientes. f Título viral general por ensayo de placa en homogeneizados pulmonares y nasales el día 5 después de la infección (n = 7 animales/grupo en dos experimentos independientes). Las líneas discontinuas indican el límite de detección, las barras representan la media y los asteriscos denotan una p < 0,05 bilateral según la prueba de Mann-Whitney en comparación con los hámsteres de control. Los números junto a los asteriscos indican el valor p exacto. ns para no significativo. Panel (c) creado con BioRender.com.

A continuación, inyectamos a los hámsteres por vía intramuscular un cóctel de MxR y 3 × 1 el día -2, los hámsteres coinfectados con HPIV3 y RSV el día 0 y los pulmones y los cornetes nasales recolectados el día 5 después de la infección (Fig. 6c). El cóctel de anticuerpos no tuvo un impacto en la replicación de HPIV3 en los cornetes nasales, pero redujo sustancialmente la carga viral en los pulmones en más de 88 veces (Fig. 6d). El cóctel de anticuerpos redujo específicamente la carga viral del RSV en los pulmones y los cornetes nasales en más de 17 y 2,9 veces, respectivamente, y el RSV estuvo por debajo del límite de detección en los pulmones de cuatro de los siete hámsteres (Fig. 6e). Usando un ensayo de placa, el cóctel de anticuerpos redujo significativamente la replicación viral combinada de HPIV3 y RSV en los pulmones a niveles indetectables en 6 de 7 animales y más de 6 veces en cornetes nasales (Fig. 6f).

Hemos aislado dos anticuerpos monoclonales antivirales de neutralización cruzada: 3 × 1 que se dirige a HPIV3 y HPIV1; y MxR, que se dirige a RSV y HMPV. Combinados, estos dos anticuerpos podrían proporcionar una protección amplia y simultánea contra cuatro de los principales virus respiratorios que afectan a los pacientes de trasplante de células madre hematopoyéticas y otras poblaciones vulnerables. Para esto, desarrollamos una estrategia de cebo y cambio basada en la lógica de que las células B capaces de unirse a un virus, mientras neutralizan otro virus, tienen más probabilidades de neutralizar ambos virus. Esta estrategia condujo al descubrimiento de 3 × 1, un anticuerpo monoclonal que neutraliza múltiples virus parainfluenza. La estrategia de cebo y cambio también podría ser un enfoque generalmente útil para identificar anticuerpos de neutralización cruzada contra otros patógenos en una situación en la que no se conocen o no todos los antígenos están disponibles. También usamos enriquecimiento magnético y clasificación celular para aislar células B raras que podrían unirse específicamente a proteínas de fusión recombinantes en la conformación preF pero no en la postF. Además, aprovechamos las células alimentadoras que expresan CD40L, IL2 e IL2127,62 para estimular la producción de anticuerpos a partir de células B individuales en cultivo. Juntas, estas técnicas permitieron el aislamiento y la detección de alto rendimiento de las células B para la neutralización cruzada.

Dirigirse a epítopos funcionalmente conservados entre virus homólogos es una estrategia atractiva para reducir el riesgo de desarrollar resistencia a los medicamentos debido a la aparición de mutaciones de escape; y, al mismo tiempo, puede aumentar el beneficio de la profilaxis previa a la exposición al proteger contra una gama más amplia de patógenos. El mAb de neutralización cruzada 3 × 1 se une a un sitio en HPIV3 preF, que llamamos sitio X, ubicado entre el ecuador y el vértice, en los vértices del trímero F de prefusión. Es posible que 3 × 1 se una al sitio de escisión de furina de HPIV3, específicamente el extremo C de la proteína F2, aunque esta región estaba demasiado desordenada para modelar de manera efectiva. Los anticuerpos que neutralizan de forma cruzada virus relacionados filogenéticamente tienden a apuntar a epítopos bien conservados63. La interacción entre protuberancias no polares en la cadena pesada de 3 × 1 con ranuras en la superficie podría representar un mecanismo que permite la unión tanto a HPIV3 como a HPIV1. Además, la cadena ligera de 3 × 1 abarca una gran protuberancia en HPIV3 preF y forma un enlace de hidrógeno en Asp143, que se conserva en HPIV1. 3 × 1 probablemente se une a la hélice HRA de HPIV3 y HPIV1, que es un sitio que experimenta un movimiento significativo durante la fusión a medida que la proteína F pasa de la conformación preF a la postF. Se necesitarán más análisis estructurales para desarrollar una mejor comprensión de las interacciones moleculares que median la neutralización 3 × 1 de HPIV1.

El MxR mAb neutraliza tanto el HMPV como el RSV y comparte similitudes notables con otro anticuerpo, MPE814,34, incluida una similitud de secuencia significativa que conduce a modos de unión comparables. Sin embargo, MxR es un anticuerpo hipermutado más somáticamente y facilita el reconocimiento del sitio III sin el CDRH3 extendido que se observa en MPE8, lo que podría proporcionar un reconocimiento del sitio favorable desde el punto de vista energético. Esta diferencia estructural puede ser la base de la diferencia observada entre MxR y MPE8 en su neutralización de HMPV, donde MxR tiene una potencia ~5,7 veces mayor.

Palivizumab es actualmente el único anticuerpo aprobado por la FDA para la prevención del RSV en bebés de alto riesgo. Sin embargo, debido a que la protección proporcionada por palivizumab está restringida al RSV, no se ha generalizado su uso en niños o adultos inmunocomprometidos en quienes otros virus como HMPV, HPIV3 y HPIV1 contribuyen significativamente a la enfermedad64. Por lo tanto, un cóctel de MxR y 3 × 1 podría satisfacer potencialmente esta necesidad insatisfecha de un fármaco de protección más amplia. La indicación clínica para el anticuerpo monoclonal D25 específico de RSV, que se está desarrollando como nirsevimab para reemplazar a palivizumab, se centra de manera similar en los lactantes33. Nosotros y otros hemos observado una unión reducida de D25 a la proteína preF del subtipo B de RSV en comparación con el subtipo A de RSV [Fig. 3c; ref. también sesenta y cinco]. Esto es notable porque se han identificado mutaciones de escape a D25 en bebés que sufrieron una infección avanzada con RSV subtipo B después de recibir nirsevimab32. RB1 es otro anticuerpo en desarrollo clínico con igual potencia contra RSV-A y -B pero no neutraliza HMPV35. El anticuerpo MxR de neutralización cruzada que describimos en el presente estudio se une fuertemente a las proteínas preF de los subtipos A y B del RSV y también neutraliza el HMPV. Un próximo paso importante en el desarrollo de MxR y 3 × 1 es un análisis de posibles mutaciones de escape que podrían surgir clínicamente y su costo de aptitud para la replicación viral.

Para investigar la posible utilidad clínica de administrar un cóctel de MxR y 3 × 1 para proteger contra RSV, HMPV, HPIV3 y HPIV1, centramos nuestros estudios de eficacia in vivo en la inmunoprofilaxis. La importancia de prevenir las infecciones virales respiratorias para las poblaciones vulnerables se ha vuelto cada vez más evidente durante la pandemia de COVID-19. La FDA autorizó un cóctel de dos anticuerpos monoclonales específicos del SARS-CoV-2 comercializados como Evusheld para la profilaxis en personas inmunocomprometidas que se espera que presenten una respuesta deficiente a la vacunación. En un ensayo de fase III, Evusheld, administrado por vía intramuscular como 600 mg de anticuerpo total, condujo a una reducción del riesgo relativo del 83 % en la COVID-1966 sintomática. Debido a las mutaciones de escape presentes en la variante omicron, la FDA revisó la dosis a 1200 mg de anticuerpo total que, para un individuo de 60 kg, es una dosis de 20 mg/kg. En nuestros estudios de eficacia in vivo, administramos de manera similar un cóctel de dos anticuerpos MxR y 3 × 1, cada uno a 5 mg/kg para una dosis total de 10 mg/kg. Por lo tanto, las dosis probadas en el presente estudio se encuentran dentro del rango de otros anticuerpos que ya están en uso clínico, lo que deja espacio para una mayor dosificación en futuros estudios en humanos. Juntos, MxR y 3 × 1 representan candidatos prometedores de mAb para un mayor desarrollo para proteger contra una amplia gama de infecciones virales respiratorias en poblaciones de pacientes altamente vulnerables.

Este estudio cumple con todas las normas éticas pertinentes y fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Oncológico Fred Hutchinson. Se obtuvo sangre periférica mediante punción venosa de voluntarios adultos sanos, seronegativos para el VIH, inscritos en el estudio de control del área de Seattle después del consentimiento informado (Protocolo n.º 5567). Las PBMC se aislaron de sangre entera utilizando el sistema Accuspin Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, nº de cat. 10771). Los estudios que involucraron bazos humanos se consideraron investigaciones con sujetos no humanos, ya que se desidentificó el tejido. Las muestras de bazo fueron consideradas investigación de sujetos no humanos por la Junta de Revisión Institucional de Fred Hutch y según lo definido por la Regla Común de la Oficina para la Protección de la Investigación Humana. El tejido se desidentificó y se originó a partir de donantes fallecidos en los que el bazo se habría descartado de otro modo durante la obtención de otros órganos (es decir, hígado) para la donación. Los fragmentos de tejido se pasaron a través de un tamiz de cesta, se centrifugaron a 300 × g durante 7 min, se incubaron con tampón de lisis ACK (Thermo Fisher, n.º de cat. A1049201) durante 3,5 min, se resuspendieron en RPMI (Gibco, n.º de cat. 11875093) y se pasaron por un Filtro de células apiladas de 500 y 70 µm. Las células se resuspendieron en dimetilsulfóxido al 10 % en suero de ternero fetal inactivado por calor (Gibco, nº de cat. 16000044) y se crioconservaron en nitrógeno líquido antes de su uso.

Se cultivaron células 293F (Thermo Fisher, n.° de cat. R79007) en medio Freestyle 293 (Thermo Fisher, n.° de cat. 12338026). Se cultivaron células Vero (ATCC CCL-81), células LLC-MK2 (ATCC CCL-7.1) y HEp-2 (ATCC CCL-23) en DMEM (Gibco, cat#12430054) suplementado con suero fetal bovino al 10 % y 100 U/mL de penicilina más 100 μg/mL de estreptomicina (Gibco, cat#15140122). Aunque HEp-2 es una línea celular comúnmente mal identificada debido a la contaminación de células HeLa (iclac.org/databases/cross-contaminations/), HEp-2 se usa tradicionalmente para cultivar RSV a títulos altos.

Los virus recombinantes RSV-GFP, HMPV-GFP, HPIV1-GFP y HPIV3-GFP se han descrito previamente46,67,68,69 y se modificaron, respectivamente, de la cepa A2 de RSV (número de acceso de GenBank KT992094), HMPV CAN97-83 (Número de acceso de GenBank AY297749), HPIV1/Washington/20993/1964 (Número de acceso de GenBank AF457102) y HPIV3 JS (Número de acceso de GenBank Z11575) para expresar una GFP mejorada. La cepa 18537 del subtipo B de RSV (número de acceso de GenBank MG813995) se obtuvo de ATCC (cat#VR-1580). La cepa B1 del subtipo B de RSV (número de acceso de GenBank AF013254.1) se obtuvo de ViraTree (cat#RSVB-GFP3). HMPV, HPIV1 y HPIV3 se cultivaron en células LLC-MK2 y RSV se cultivó en células HEp-2. El virus se purificó por centrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa al 30 %/60 % con HEPES 0,05 M y MgSO4 0,1 M (Sigma-Aldrich, n.º de cat. H4034 y 230391, respectivamente) a 120 000 × g durante 90 min a 4 °C. Los títulos de virus se determinaron infectando monocapas de células Vero en placas de 24 pocillos con diluciones seriadas de 10 veces del virus, cubriendo con DMEM que contenía 0,8 % de metilcelulosa (Sigma-Aldrich, nº de cat. M0387). Para los ensayos relacionados con HPIV1 y HMPV, se incluyó en el medio 1,2 % de 0,05 % de tripsina (Gibco, n.° de cat. 25300054). Las placas fluorescentes se contaron usando un escáner Typhoon (GE Life Sciences) 5 días después de la infección.

Los plásmidos de expresión para los antígenos preF y postF de RSV, HMPV y HPIV3 marcados con His se han descrito previamente26,70,71. Las células 293F se transfectaron a una densidad de 106 células/mL en medio Freestyle 293 usando 1 mg/mL de PEI Max (Polysciences, nº de catálogo 24765). Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días con agitación suave a 37 °C. El sobrenadante se recogió centrifugando los cultivos a 2500 xg durante 30 min seguido de filtración a través de un filtro de 0,2 µM. El sobrenadante clarificado se incubó con perlas de Ni Sepharose durante la noche a 4 °C, seguido de lavado con tampón de lavado que contenía Tris 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 8 mM. La proteína etiquetada con His se eluyó con un tampón de elución que contenía Tris 25 mM, NaCl 150 mM e imidazol 500 mM. La proteína purificada se pasó por una columna de exclusión por tamaño Superose 6 10/300 (GE Life Sciences, nº de cat. 17–5172–01). Las fracciones que contenían las proteínas F triméricas se agruparon y concentraron mediante centrifugación en una unidad de ultrafiltración Amicon de 50 kDa (Millipore, n.° de cat. UFC805024). La muestra concentrada se almacenó en glicerol al 50 % a -20 °C.

Los antígenos F purificados se biotinilaron usando un kit de biotinilación EZ-link Sulfo-NHS-LC (Thermo Fisher, cat#A39257) con una proporción molar de biotina a F de 1:1,3. La biotina no conjugada se eliminó por centrifugación usando un Amicon Ultra de 50 kDa. columna de exclusión por tamaño (Millipore). Para determinar el número promedio de moléculas de biotina unidas a cada molécula de F, se tituló estreptavidina-PE (ProZyme, cat#PJRS25) en una cantidad fija de F biotinilado en concentraciones crecientes y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Las muestras se corrieron en un gel SDS-PAGE (Invitrogen, n.º de cat. NW04127BOX), se transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron con estreptavidina-Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher, n.º de cat. S32358) a una dilución de 1:10 000 para determinar el punto en el que había un exceso de biotina disponible para que se uniera el reactivo estreptavidina-Alexa Fluor 680. El F biotinilado se mezcló con estreptavidina-aloficocianina (APC) o estreptavidina-PE en la proporción determinada anteriormente para saturar completamente la estreptavidina y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. El F no conjugado se eliminó por centrifugación utilizando un dispositivo centrífugo Nanosep de 300 K (Pall Corporation, n.° de catálogo OD300C33). Los tetrámeros APC/DyLight755 y PE/DyLight650 se crearon mezclando F con estreptavidina-APC preconjugada con DyLight755 (Thermo Fisher, cat#62279) o estreptavidina-PE preconjugada con DyLight650 (Thermo Fisher, cat#62266), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante. En promedio, APC/DyLight755 y PE/DyLight650 contenían de 4 a 8 moléculas de DyLight por APC y PE. La concentración de cada tetrámero se calculó midiendo la absorbancia de APC (650 nm, coeficiente de extinción = 0,6 µM−1 cm−1) o PE (566 nm, coeficiente de extinción = 2,0 µM−1 cm−1).

Se descongelaron 1–2 × 108 PBMC congeladas o 4–8 × 107 células de bazo congeladas en DMEM con suero de ternero fetal al 10% y 100 U/mL de penicilina más 100 µg/mL de estreptomicina. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 µl de tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) enfriado con hielo compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS) y suero de ternero recién nacido al 1 % (Thermo Fisher, n.º de cat. 26010074). Se añadieron tetrámeros conjugados PostF APC/DyLight755 y PE/Dylight650 a una concentración final de 25 nM en presencia de suero de rata y ratón al 2% (Thermo Fisher) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, se añadieron tetrámeros PreF APC y PE a una concentración final de 5 nM y se incubaron en hielo durante 25 min, seguido de un lavado de 10 ml con tampón FACS enfriado con hielo. A continuación, se añadieron 50 μL de microperlas conjugadas anti-APC (Miltenyi Biotec, n.º de cat. 130-090-855) y conjugadas con anti-PE (Miltenyi Biotec, n.º de cat. 130-048-801) y se incubaron en hielo durante 30 min, después de lo cual se añadieron 3 ml de tampón FACS y la mezcla se pasó por una columna LS magnetizada (Miltenyi Biotec, nº de cat. 130-042-401). La columna se lavó una vez con 5 ml de tampón FACS enfriado con hielo y luego se retiró del campo magnético y se empujaron 5 ml de tampón FACS enfriado con hielo a través de la columna no magnetizada dos veces usando un émbolo para eluir la fracción celular unida.

Las células se incubaron en 50 μL de tampón FACS que contenía un cóctel de anticuerpos durante 30 min en hielo antes del lavado y análisis en un FACS Aria (BD). Los anticuerpos incluyeron FITC anti-IgM (G20–127, BD, n.° de cat. 555782, dilución 1:80), anti-CD19 BUV395 (SJ25C1, BD, n.° de cat. 563551, dilución 1:20), anti-CD3 BV711 (UCHT1, BD , n.° de cat. 563725, dilución 1:50), anti-CD14 BV711 (M0P-9, BD, n.° de cat. 563372, dilución 1:50), anti-CD16 BV711 (3G8, BD, n.° de cat. 563127, dilución 1:50) , anti-CD20 BUV737 (2H7, BD, n.° de cat. 612849, dilución 1:20), anti-IgD BV605 (IA6–2, BD, n.° de cat. 563313, dilución 1:50), anti-CD27 PE/Cy7 (LG. 7F9, eBioscience, n.° de cat. 25-0271-82, dilución 1:160) y un tinte de viabilidad fijable (Tonbo Biosciences, n.° de cat. 13-0870-T500, dilución 1:250). Las células B se clasificaron individualmente en 1) placas de PCR de 96 pocillos vacías y se congelaron inmediatamente, o 2) placas de 96 pocillos de fondo plano que contenían células alimentadoras que se habían sembrado a una densidad de 28 600 células/pocillo un día antes en 100 µL de Medios IMDM (Gibco, n.° de cat. 31980030) que contienen suero fetal bovino al 10 %, 100 U/ml de penicilina más 100 µg/ml de estreptomicina y 2,5 µg/ml de anfotericina. Las células B clasificadas en células alimentadoras se cultivaron a 37 °C durante 13 días.

Para las células B individuales clasificadas y congeladas en placas de PCR de 96 pocillos vacías, la transcripción inversa (RT) se realizó directamente después de descongelar las placas utilizando SuperScript IV (Thermo Fisher, n.° de cat. 18090200)72,73. Brevemente, mezcla de reacción de RT de 3 µL que consta de 3 µL de hexámeros aleatorios 50 µM (Thermo Fisher, n.º de cat. 48190011), 0,8 µL de trifosfatos de desoxirribonucleótidos 25 mM (dNTP; Thermo Fisher, n.º de cat. N8080261), 1 µL (20 U) SuperScript IV RT, 0.5 µL (20 U) RNaseOUT (Thermo Fisher, cat#10777019), 0.6 µL de Igepal al 10% (Sigma-Aldrich, cat#I8896) y 15 µL de agua libre de RNase se agregaron a cada pocillo que contenía una sola linfocitos B clasificados e incubados a 50 °C durante 1 h. Para las células B individuales clasificadas en células alimentadoras, el sobrenadante se eliminó después de 13 días de cultivo, las placas se congelaron inmediatamente en hielo seco, se almacenaron a -80 °C, se descongelaron y se extrajo el ARN con el kit RNeasy Micro (Qiagen, n.° de cat. 74034). Se usó todo el eluato de la extracción de ARN en lugar de agua en la reacción de RT. Después de la RT, se agregaron 2 µL de cDNA a 19 µL de la mezcla de reacción de PCR para que la reacción final contuviera 0,2 µL (0,5 U) de polimerasa HotStarTaq (Qiagen, n.° de cat. 203607), 0,075 µL de cebadores inversos 50 µM 3′, 0,115 µL de Cebadores directos 5 '50 μM, 0,24 μl de dNTP 25 mM, 1,9 μl de tampón 10 × (Qiagen) y 16,5 μl de agua. El programa de PCR fue de 50 ciclos de 94 °C durante 30 s, 57 °C durante 30 s y 72 °C durante 55 s, seguido de 72 °C durante 10 min para cadenas ligeras kappa y pesadas. El programa de PCR fue de 50 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 55 s, seguido de 72 °C durante 10 min para las cadenas ligeras lambda. Después de la primera ronda de PCR, se agregaron 2 µL del producto de PCR a 19 µL de la segunda ronda de reacción de PCR para que la reacción final contuviera 0,2 µL (0,5 U) de polimerasa HotStarTaq, 0,075 µL de cebadores inversos 3′ 50 µM, 0,075 μl de cebadores directos 5' 50 μm, 0,24 μl de dNTP 25 mM, 1,9 μl de tampón 10 × y 16,5 μl de agua. Los programas de PCR fueron los mismos que la primera ronda de PCR. Se corrieron 4 μL del producto de PCR en un gel de agarosa para confirmar la presencia de una banda de cadena pesada de ~500 pb o una banda de cadena ligera de ~450 pb. Se mezclaron 5 μL de las reacciones de PCR que mostraban la presencia de amplicones de cadena ligera o pesada con 2 μL de ExoSAP-IT (Thermo Fisher, cat#78201) y se incubaron a 37 °C durante 15 min seguidos de 80 °C durante 15 min para hidrolizar el exceso de cebadores y nucleótidos. Genewiz secuenció los productos de PCR de segunda ronda hidrolizados con el cebador inverso respectivo usado en la PCR de segunda ronda, y las secuencias se analizaron usando IMGT/V-Quest para identificar los segmentos de genes V, D y J. Las secuencias VDJ de cadena pesada y VJ de cadena ligera emparejadas se clonaron en vectores de expresión derivados de pTT3 que contenían las regiones constantes de IgG1, IgK o IgL humana utilizando la clonación In-Fusion (Clontech, n.° de cat. 638911)74.

La IgG secretora se produjo cotransfectando células 293F a una densidad de 106 células/mL con los plásmidos de expresión de cadena ligera y pesada emparejados en una proporción de 1:1 en medio Freestyle 293 usando 1 mg/mL de PEI máx. Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días con agitación suave a 37 °C. El sobrenadante se recogió centrifugando los cultivos a 2500 xg durante 15 min seguido de filtración a través de un filtro de 0,2 µM. A continuación, los sobrenadantes clarificados se incubaron con proteína A agarosa (Thermo Scientific, n.º de catálogo 22812) seguido de lavado con tampón de unión a IgG (Thermo Scientific, n.º de catálogo 21007). Los anticuerpos se eluyeron con tampón de elución IgG (Thermo Scientific, nº de catálogo 21004) en un tampón de neutralización que contenía base Tris 1 M, pH 9,0. El anticuerpo purificado se concentró y el tampón se intercambió por PBS utilizando una unidad de ultrafiltración Amicon con un límite de peso molecular de 50 kDa.

Fab se produjo incubando 10 mg de IgG con 10 µg de LysC (New England Biolabs, cat#P8109S) durante la noche a 37 °C seguido de incubación con proteína A durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, la mezcla se centrifugó a través de un filtro de PVDF, se concentró en PBS con una columna de exclusión por tamaño Amicon Ultra de 30 kDa y se purificó aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) usando Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences, cat#17–5175–01 ) en HEPES 5 mM y NaCl 150 mM.

Los ensayos de interferometría de biocapa (BLI) se realizaron en el instrumento Octet.Red (ForteBio) a temperatura ambiente con agitación a 500 rpm. Para los análisis de afinidad aparente (KD), se cargaron sensores de captura anti-penta His (ForteBio, cat#18-5120) en tampón de cinética (PBS con albúmina de suero bovino al 0,01 %, Tween 20 al 0,02 % y NaN3 al 0,005 %, pH 7,4) que contiene RSV-A, RSV-B, HMPV o HPIV3 preF purificados 0,5 µM durante 150 s. Después de la carga, la señal de referencia se registró durante 60 s en un tampón de cinética. A continuación, los sensores se sumergieron en tampón cinético que contenía 266,7, 133,3, 66,7, 33,3 o 16,7 nM de anticuerpo monoclonal purificado durante un paso de asociación de 300 s seguido de inmersión en tampón cinético durante una fase de disociación de al menos 600 s. La respuesta máxima se determinó promediando el cambio de nanómetros durante los últimos 5 s del paso de asociación después de restar la señal de fondo de cada pocillo que contenía el analito usando un mAb de control negativo en cada punto de tiempo. El ajuste de la curva se realizó utilizando un modelo de unión 1:1 y el software de análisis de datos ForteBio Octet, versión 9.0. Para los ensayos de unión competitiva, se cargaron sensores de captura anti-penta His en tampón de cinética que contenía HPIV3 preF marcado con His 1 µM durante 300 s. Después de la carga, la señal de referencia se registró durante 30 s en el tampón de cinética. A continuación, los sensores se sumergieron durante 300 s en tampón cinético que contenía 40 µg/ml del primer anticuerpo, seguido de inmersión durante otros 300 s en tampón cinético que contenía 40 µg/ml del segundo anticuerpo. El porcentaje de competición se determinó dividiendo el aumento máximo de la señal del segundo anticuerpo en presencia del primer anticuerpo por la señal máxima del segundo anticuerpo solo.

Las células Vero se sembraron en placas de fondo plano de 96 pocillos por duplicado y se cultivaron durante 48 h y luego se incubaron con HPIV3 a una MOI = 0,01 durante una hora a 37 °C. Las células se lavaron cinco veces para eliminar el virus no adsorbido. Se añadió a las células 3 × 1 (10 µg/mL) o medio (control). La propagación de célula a célula y la formación de sincitios se examinaron los días 1, 3 y 5 después de la infección utilizando un sistema de formación de imágenes de células EVOS (Thermo Fisher).

Para el cribado de neutralización de los sobrenadantes de cultivo, se sembraron células Vero en placas de fondo plano de 96 pocillos y se cultivaron durante 48 h. Después de 13 días de cultivo, se mezclaron 40 µL de sobrenadante de cultivo de células B con 25 µL de GFP-HPIV1 purificado con sacarosa diluido a 2000 unidades formadoras de placa (ufp)/mL durante 1 h a 37 °C. A continuación, las células Vero se incubaron con 50 µl de la mezcla de sobrenadante/virus durante 1 hora a 37 °C para permitir la adsorción viral. A continuación, cada pocillo se cubrió con 100 µl de DMEM que contenía 0,8 % de metilcelulosa y 1,2 % de 0,05 % de tripsina. Las placas fluorescentes se contaron 5 días después de la infección utilizando un generador de imágenes Typhoon.

Los títulos neutralizantes de anticuerpos monoclonales se determinaron mediante una prueba de neutralización por reducción de placas al 60% (PRNT60). Las células Vero se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 48 h. Los anticuerpos monoclonales se diluyeron en serie 1:4 en 120 µl de DMEM y se mezclaron con 120 µl de RSV, HMPV, HPIV3 o HPIV1 purificados con sacarosa diluidos a 2000 ufp/ml durante una hora a 37 °C. Las células Vero se incubaron con 100 µl de la mezcla de anticuerpo/virus durante 1 hora a 37 °C para permitir la adsorción viral. A continuación, se cubrió cada pocillo con 500 µl de DMEM que contenía metilcelulosa al 0,8 %. Las placas fluorescentes se contaron 5 días después de la infección utilizando un generador de imágenes Typhoon. Los títulos de PRNT60 se calcularon mediante análisis de regresión lineal (http://exon.niaid.nih.gov/plaquereduction/).

Se mezclaron 1,47 mg de RSV preF con 1,45 mg de MxR Fab y se incubaron durante la noche a 4 °C con balanceo suave, antes de la purificación SEC en una columna 10/300 Superose 6 (Cytiva, n.° de catálogo 29091596). Eluyó un pico muy amplio, con las nueve fracciones más grandes concentradas a 0,22 mg/mL usando una unidad de ultrafiltración Amicon de corte de 10 kDa (Sigma-Aldrich, cat#UFC8030). Para 3 × 1, incubamos 50 µg de HPIV3 preF con 150 µg de Fab 3 × 1 durante la noche a 4 °C con balanceo suave antes de la purificación SEC en una columna Superdex 200 16/600 SEC (Cytiva, n.º de cat. 28989335). Se eluyó un único pico estrecho de alto peso molecular y se concentró a 0,4 mg/ml utilizando una unidad de ultrafiltración Amicon con corte de 10 kDa.

Ambos complejos se congelaron en rejillas de malla Quantifoil 1.2/1.3 UltrAu 300 (Electron Microscopy Sciences, cat#Q350AR13A) usando un Vitrobot Mk. IV (Thermo Fisher) a 22 °C y 100% de humedad. Se añadió dodecil-β-d-maltósido (DDM) a la muestra (concentración final del 0,05 %) 30 min antes del inicio de la congelación, y se usó un PELCO easiGlow™ (Tedpella, Cat#91000) para la descarga luminiscente de las rejillas. Las rejillas MxR:RSV finales utilizadas para la recolección se congelaron con 4 µL de la muestra a 0,21 mg/mL, un tiempo de transferencia de 14 s, fuerza de transferencia 0 y una espera de 5 s entre la aplicación y la transferencia. Las rejillas finales 3 × 1:HPIV3 utilizadas para la recolección se congelaron con 4 µL de la muestra a 0,19 mg/mL, un tiempo de transferencia de 12 s, fuerza de transferencia 0 y una espera de 15 s entre la aplicación y la transferencia.

Los conjuntos de datos se recolectaron en un microscopio crioelectrónico Titan Krios G3 (Thermo Fisher Scientific) que opera a 300 kV con un K3 DED (Gatan Inc.) en el Pacific Northwest Center for Cryo-EM (PNCC). Los datos se recopilaron en películas de 50 fotogramas utilizando Serial EM con un aumento de ×92 000 (0,514425 Å/px utilizando el modo de superresolución). Ambas colecciones se ejecutaron durante 24 h, produciendo 6282 películas para 3 × 1:HPIV3 y 5796 películas para MxR:RSV. 3 × 1:HPIV3 se recolectó con una inclinación de 30° debido a la orientación preferida observada durante la selección.

Los conjuntos de datos se procesaron utilizando cryoSPARC v3.3.175. Después de la importación, la corrección del movimiento del parche (micrografías agrupadas en 1,02885 Å/px) y la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF), las micrografías se seleccionaron para un ajuste de <4 Å CTF. El selector de blobs se utilizó para seleccionar ~ 50 000 partículas, que se sometieron a una clasificación 2D para producir plantillas para la selección basada en plantillas. Estas selecciones se inspeccionaron, seleccionaron y extrajeron (tamaño de caja de 192 píxeles a 2,0577 Å/px) con 1,49 millones de partículas para MxR:RSV y 2,02 millones de partículas para 3 × 1:HPIV3.

Después de dos rondas de clasificación 2D, 100 clases cada una, nos quedaron 377 982 partículas MxR:RSV que mostraban tres Fab unidos. Se generó y refinó un solo modelo ab-initio. Las partículas se volvieron a extraer a 1,02885 Å/px y se sometieron a refinamiento CTF local y refinamiento no uniforme con simetría C3. Después de esto, las partículas se curaron y volvieron a extraer utilizando la Corrección de movimiento local, produciendo 354 958 partículas. El refinamiento no uniforme con una máscara personalizada que recortaba la región CH1 y el dominio GCN4 produjo un mapa nítido (GSFSC = 0,143) de resolución de 2,41 Å con simetría C1 y de 2,24 Å con simetría C3.

La generación de plantillas para 3 × 1:HPIV3 produjo una combinación de clases con uno, dos o tres Fab enlazados, todos los cuales se usaron para la selección de plantillas originales. Realizamos una ronda de clasificación 2D con 100 clases, seleccionando partículas solitarias que mostraban cualquier número de Fab unidos, produciendo una pila de 1,3 millones de partículas. El modelado ab-initio produjo un solo mapa con un Fab unido a HPIV3 preF, y el refinamiento posterior produjo un mapa con una resolución GSFSC de 3,7 Å en los puntos de corte de 0,143 usando simetría C1. Se produjo un mapa adicional de tres Fab con simetría C3 en un refinamiento no uniforme a 4,3 Å, aunque debido a la baja resolución, este mapa no se usó en la construcción del modelo. Se realizaron mejoras menores mediante la realización de un refinamiento homogéneo C3, seguido de la expansión de la simetría C3, la clasificación 3D con cuatro clases y la eliminación de partículas duplicadas de la clase más homóloga, lo que produjo una pila de 1,04 millones de partículas. Las partículas se volvieron a extraer con el trabajo de Corrección de movimiento local, se agruparon en 1,02885 Å/px y el mapa se refinó mediante el refinamiento no uniforme C1. Esto produjo nuestro mapa afilado final con una resolución de 3,62 Å (GSFSC = 0,143).

Ambos mapas finales se procesaron posteriormente utilizando la computadora COSMIC276 con el módulo DeepEMhancer77. Tanto los mapas nítidos mejorados de DeepEM como los de crioSPARC se utilizaron para ajustar las estructuras de MxR:RSV y 3 × 1:HPIV3 al mapa. El refinamiento y la validación de la estructura se realizaron en el paquete de software Phenix78 y Coot79. Se realizó un refinamiento adicional en ChimeraX80 utilizando el complemento ISOLDE81 según sea necesario. Los medios mapas desenmascarados, los mapas afilados y las máscaras utilizadas se depositaron en el PDB y el EMDB. Todos los gráficos fueron producidos en Pymol82. Los gráficos se prepararon con GraphPad Prism 9. El análisis del área de superficie enterrada se llevó a cabo con el servidor PDBePISA83.

Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Fred Hutch y se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y de los Institutos Nacionales de Salud. Se infectaron hámsteres sirios dorados (Mesocricetus auratus) por vía intranasal con 100 µl de 105 pfu de RSV, HMPV, HPIV3 o HPIV1. Los tamaños de muestra (en general n = 24 para experimentos de concentración de anticuerpos séricos, n = 96 para experimentos de infección única y n = 24 para experimentos de coinfección) fueron consistentes con experimentos publicados previamente que probaron la eficacia de los anticuerpos monoclonales del RSV en el modelo de rata algodonera58, 59,84,85. En este trabajo solo se evaluaron animales machos (de 4 a 8 semanas de edad), porque no se ha observado asociación entre el sexo y los resultados clínicos en adultos con RSV, HMPV, HPIV3 o HPIV186,87. El anticuerpo monoclonal se administró por vía intramuscular a 5, 2,5 o 1,25 mg/kg en 50 µl de PBS 2 días antes de la infección. Para el modelo de coinfección, se mezclaron 105 ufp de cada virus en 100 µL de 1 × DPBS y 5 mg/kg de cada anticuerpo monoclonal en 50 µL de 1 × DPBS. Los cornetes nasales y los pulmones se extrajeron para la titulación viral mediante un ensayo de placas 5 días después de la infección y se aclararon mediante centrifugación en DMEM. Se inocularon monocapas de células Vero confluentes por duplicado con homogeneizados diluidos en placas de 24 pocillos. Después de incubar durante 1 hora a 37 °C, los pocillos se cubrieron con metilcelulosa al 0,8 % (preparada con 1,2 % de tripsina al 0,05 % para muestras de animales expuestos a HMPV y HPIV1). Después de 5 días, se contaron las placas utilizando el generador de imágenes Typhoon para determinar los títulos como ufp por gramo de tejido. También se guardaron alícuotas de muestras de cornete nasal y pulmón para la cuantificación de la carga viral mediante PCR en tiempo real.

Las concentraciones séricas de MxR y 3 × 1 se midieron mediante ELISA. Brevemente, se recubrieron placas Nunc maxsorp de 96 pocillos (Thermo Fisher, n.° de cat. 442404) con 100 ng de Fab antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch, n.° de cat. 109-005-097) durante 90 min a 4 °C. Los pocillos se lavaron tres veces con 1 x DPBS y luego se incubaron con 1 x DPBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (Sigma-Aldrich, nº de cat. A2153) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas recubiertas de antígeno se incubaron con suero durante 90 min a 4 °C. Se generó una curva estándar con diluciones dobles en serie de palivizumab. Los pocillos se lavaron tres veces con 1xDPBS seguido de una hora de incubación con Ig total antihumana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante a una dilución de 1:6000 (Invitrogen, nº de catálogo 31412). A continuación, los pocillos se lavaron cuatro veces con 1xDPBS seguido de una incubación de 5 a 15 min con sustrato TMB (SeraCare, nº de cat. 5120-0053). La absorbancia se midió a 405 nm utilizando un lector de placas Softmax Pro (Molecular Devices). La concentración de anticuerpo en cada muestra se determinó con referencia a la curva estándar y el factor de dilución.

El ARN viral se extrajo de 140 μL de homogeneizado de muestra utilizando el mini kit QIAamp vRNA (Qiagen, n.° de catálogo 52904). El ARN se eluyó con 50 µl de agua y se usaron 11 µl del eluato para la transcripción inversa. Se diseñaron cebadores de transcripción inversa personalizados para RSV (5'-TCCAGCAAATACACCATCCAAC-3') y HPIV3 (5'-CTAGAAGGTCAAGAAAAGGGAACTC-3') para unirse específicamente a los genomas de RSV y HPIV3, respectivamente. Se incluyó un microlitro de cada cebador a 2 µM en una mezcla de reacción de RT que contenía 1 µL de RNaseOut, 1 µL de 0,1 M DTT, 4 µL de tampón SuperScript IV y 1 µL de transcriptasa inversa SuperScript IV (Thermo Fisher, nº de catálogo 18090200 ). La transcripción inversa se realizó con el siguiente ciclo: 42 °C durante 10 min, 20 °C durante 10 min, 50 °C durante 10 min y 80 °C durante 10 min. Se desarrollaron ensayos de expresión génica TaqMan personalizados para RSV (cebador directo 5'-TGACTCTCCTGATTGTGGGATGATA-3', cebador inverso 5'-CGGCTGTAAGACCAGATCTGT-3' y reportero 5'-CCCCTGCTGCTAATTT-3') y HPIV3 (cebador directo, 5'-CGGTGACACAGTGGATCAGATT -3', cebador inverso 5'-TGTTTCAACCATAAGAGGTACCAAGCT-3' y reportero 5'-ACCGCATGATTGACCC-3'). La reacción de PCR consistió en 2,5 µL de estos cebadores, 10 µL de la reacción de transcripción inversa, 25 µL de TaqMan Universal Master Mix II con UNG (Thermo Fisher, nº de cat. 4440038) y 12,5 µL de agua. La PCR en tiempo real se realizó con el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 7 Flex con los siguientes parámetros: 50 °C durante 2 min y 95 °C durante 10 min seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 minuto. Para generar una curva estándar, el ARN viral se extrajo de stocks virales purificados con sacarosa de RSV con títulos conocidos en ufp/mL. La transcripción inversa se realizó como anteriormente. La reacción de transcripción inversa se diluyó en serie ocho veces a 1:4 en agua. La PCR en tiempo real se realizó como se indicó anteriormente y se generaron curvas estándar para interpolar las cargas virales a ufp/g utilizando el software QuantStudio Real-time PCR v1.0.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 7. Las comparaciones estadísticas por pares se realizaron con la prueba de dos colas de Mann-Whitney. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se muestran los puntos de datos de muestras individuales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos estructurales y de secuenciación que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en el Banco de datos de proteínas (PDB) y el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) y se puede acceder a ellos a través de los números de acceso PDB 8DG8 (EMDB 27418) para 3×1/HPIV3 y PDB 8DG9 (EMDB 27419) para MXR/RSV. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Giraud-Gatineau, A. et al. Comparación de la mortalidad asociada a infecciones virales respiratorias entre diciembre de 2019 y marzo de 2020 con la del año anterior en el sureste de Francia. En t. J. infectar. Dis. 96, 154–156 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruckwardt, TJ, Morabito, KM & Graham, BS Lecciones inmunológicas del desarrollo de vacunas contra el virus respiratorio sincitial. Inmunidad 51, 429–442 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Drysdale, SB et al. Prioridades para el desarrollo de vacunas contra el virus respiratorio sincitial en diferentes poblaciones objetivo. ciencia Traducir Medicina. 12, eaax2466 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kennedy, LB, Li, Z., Savani, BN & Ljungman, P. Medición de la respuesta inmune a las vacunas de uso común en receptores adultos de trasplante alogénico de células hematopoyéticas. Biol. Trasplante de Médula Sanguínea 23, 1614-1621 (2017).

Artículo Google Académico

Ambati, A. et al. Evaluación de la vacunación antigripal pretrasplante en SCT hematopoyético: un estudio prospectivo aleatorizado. Trasplante de Médula Ósea 50, 858–864 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Harris, AE et al. Vacunas previas al trasplante en donantes y receptores de trasplantes alogénicos de células madre: ¿una oportunidad que a menudo se pierde para la inmunoprotección? Trasplante de Médula Ósea 50, 899–903 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Boeckh, M. El desafío de las infecciones por virus respiratorios en receptores de trasplantes de células hematopoyéticas. Hermano J. Haematol. 143, 455–467 (2008).

PubMed PubMed Central Google Académico

Erard, V. et al. Disminución del flujo de aire después del trasplante de células hematopoyéticas alogénicas mieloablativas: el papel de los virus respiratorios comunitarios. J. infectar. Dis. 193, 1619–1625 (2006).

Artículo PubMed Google Académico

Agha, R. & Avner, JR Aumento estacional retrasado del RSV observado durante la pandemia de COVID-19. Pediatría 148, e2021052089 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Foley, DA et al. El resurgimiento interestacional del virus respiratorio sincitial en niños australianos luego de la reducción de las medidas de salud pública relacionadas con la enfermedad por coronavirus 2019. clin. Infectar. Dis. 73, e2829–e2830 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sieling, WD et al. Incidencia comparativa y carga de virus respiratorios asociados con la hospitalización en adultos en la ciudad de Nueva York. Influenza Otras Respir. Virus 15, 670–677 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, N. et al. Carga de infecciones virales respiratorias no relacionadas con la influenza en adultos ingresados ​​en el hospital: análisis de una cohorte de vigilancia canadiense de varios años de 2 centros. CMAJ 193, E439–E446 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, RE et al. El impacto de las intervenciones no farmacéuticas de COVID-19 en la dinámica futura de las infecciones endémicas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 117, 30547–30553 (2020).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corti, D. et al. Neutralización cruzada de cuatro paramixovirus por un anticuerpo monoclonal humano. Naturaleza 501, 439–443 (2013).

Artículo CAS ANUNCIOS PubMed Google Académico

Schiffer, JT et al. Momento y gravedad de las infecciones por virus respiratorios adquiridas en la comunidad después de un trasplante de células madre hematopoyéticas mieloablativo versus no mieloablativo. Haematologica 94, 1101–1108 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Crotty, MP et al. Epidemiología, coinfecciones y resultados de la neumonía viral en adultos: un estudio de cohorte observacional. Medicina 94, e2332 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sáez-Llorens, X. et al. Seguridad y farmacocinética de la terapia con palivizumab en niños hospitalizados con infección por virus respiratorio sincitial. pediatra Infectar. Dis. J. 23, 707–712 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Meissner, HC Bronquiolitis viral en niños. N. ingl. J.Med. 374, 62–72 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Polack, FP, Stein, RT & Custovic, A. El síndrome que acordamos llamar bronquiolitis. J. infectar. Dis. 220, 184–186 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

White, JM, Delos, SE, Brecher, M. & Schornberg, K. Estructuras y mecanismos de las proteínas de fusión de membrana viral: múltiples variaciones sobre un tema común. crítico Rev. Bioquímica. mol. Biol. 43, 189–219 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Connolly, SA, Leser, GP, Yin, HS, Jardetzky, TS & Lamb, RA Replegamiento de una proteína F de paramixovirus desde conformaciones de prefusión a postfusión observadas por unión de liposomas y microscopía electrónica. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 103, 17903–17908 (2006).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ngwuta, JO et al. Los anticuerpos específicos de prefusión F determinan la magnitud de la actividad neutralizante del RSV en sueros humanos. ciencia Traducir Medicina. 7, 309ra162 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Gilman, MS et al. Perfilado rápido de repertorios de anticuerpos RSV de las células B de memoria de donantes adultos infectados de forma natural. ciencia inmunol. 1, eaaj1879 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yin, HS, Paterson, RG, Wen, X., Lamb, RA & Jardetzky, TS Estructura del ectodominio no escindido de la proteína de fusión del paramixovirus (hPIV3). proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 102, 9288–9293 (2005).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moscona, A. Interacción del virus de la parainfluenza humana tipo 3 con la superficie de la célula huésped. pediatra Infectar. Dis. J. 16, 917–924 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stewart-Jones, GBE et al. Diseño basado en la estructura de una vacuna de glicoproteína de fusión tetravalente para el virus de la parainfluenza humana tipos 1-4. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, 12265–12270 (2018).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boonyaratanakornkit, J. et al. Anticuerpos protectores contra la infección por el virus de la parainfluenza humana tipo 3. MAbs 13, 1912884 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Batallas, MB et al. Estructura e inmunogenicidad de la glicoproteína F del metapneumovirus humano estabilizada antes de la fusión. Nat. común 8, 1528 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mas, V. et al. Ingeniería, estructura e inmunogenicidad de la proteína F del metapneumovirus humano en la conformación posfusión. Patog de PLoS. 12, e1005859 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Henrickson, KJ Virus de la parainfluenza. clin. Microbiol Rev. 16, 242–264 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Graham, BS Desarrollo de vacunas para el virus respiratorio sincitial. actual Opinión Virol. 23, 107–112 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Griffin, MP et al. Nirsevimab de dosis única para la prevención del RSV en recién nacidos prematuros. N. ingl. J.Med. 383, 415–425 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hammitt, LL et al. Nirsevimab para la prevención del RSV en recién nacidos a término y prematuros tardíos sanos. N. ingl. J.Med. 386, 837–846 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wen, X. et al. Base estructural para la neutralización cruzada de anticuerpos del virus respiratorio sincitial y el metapneumovirus humano. Nat. Microbiol. 2, 16272 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, A. et al. Un potente anticuerpo VSR humano ampliamente neutralizante se dirige al sitio IV conservado de la glicoproteína de fusión. Nat. común 10, 4153 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilman, MSA et al. Apertura transitoria de proteínas RSV F de prefusión trimérica. Nat. común 10, 2105 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mousa, JJ et al. Reconocimiento de anticuerpos humanos del sitio antigénico IV en proteínas de fusión de Pneumovirus. Patog de PLoS. 14, e1006837 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Harshbarger, W. et al. Características estructurales convergentes de los anticuerpos neutralizantes del virus sincitial respiratorio y la plasticidad del epítopo del sitio V en la prefusión F. PLoS Pathog. 16, e1008943 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goodwin, E. et al. Los lactantes infectados con el virus respiratorio sincitial generan potentes anticuerpos neutralizantes que carecen de hipermutación somática. Inmunidad 48, 339–349 e335 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ottolini, MG et al. Replicación semipermisiva y aspectos funcionales de la respuesta inmune en un modelo de rata algodonera de infección por el virus de la parainfluenza humana tipo 3. J. Gen. Virol. 77, 1739-1743 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Boukhvalova, MS, Prince, GA & Blanco, JC El modelo de rata de algodón de infecciones virales respiratorias. Productos biológicos 37, 152–159 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Niewiesk, S. y Li, J. Modelos de animales pequeños para el metapneumovirus humano: la rata de algodón es más permisiva que el hámster y el ratón. Patógenos 3, 633–655 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wyde, PR, Chetty, SN, Jewell, AM, Schoonover, SL y Piedra, PA Desarrollo de un modelo de metapneumovirus humano-rata del algodón (hMPV) para identificar y evaluar posibles antivirales y vacunas contra el hMPV. antivirus Res. 66, 57–66 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Skiadopoulos, MH et al. Evaluación de la replicación e inmunogenicidad de vectores recombinantes del virus de la parainfluenza humana tipo 3 que expresan hasta tres glicoproteínas extrañas. Virología 297, 136–152 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Newman, JT et al. Generación de candidatos vacunales recombinantes del virus de la parainfluenza humana tipo 1 mediante la importación de mutaciones atenuantes y sensibles a la temperatura de paramixovirus heterólogos. J.Virol. 78, 2017–2028 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. et al. El virus de la parainfluenza humana tipo 3 que expresa la proteína F de prefusión del virus sincitial respiratorio modificada para el empaquetamiento de viriones produce candidatos a vacunas intranasales protectoras. PLoS ONE 15, e0228572 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. Generación de cepas de metapneumovirus humano sensibles a la temperatura que proporcionan inmunidad protectora en hámsters. J. Gen. Virol. 89, 1553-1562 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wen, SC & Williams, JV Nuevos enfoques para la inmunización y la terapia contra el metapneumovirus humano. clin. vacuna inmunol. 22, 858–866 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Bartlett, EJ et al. Las proteínas C del virus de la parainfluenza humana tipo 1 son proteínas no esenciales que inhiben el interferón del huésped y las respuestas apoptóticas y son necesarias para una replicación eficiente en primates no humanos. J.Virol. 82, 8965–8977 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. La inmunización de hámsters dorados sirios con vacuna de subunidad F de metapneumovirus humano induce protección contra el desafío con cepas homólogas o heterólogas. J. Gen. Virol. 88, 2702–2709 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schickli, JH et al. La eliminación del metapneumovirus humano M2-2 aumenta la frecuencia de mutación y atenúa el crecimiento en hámsters. Virol. J. 5, 69 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Skiadopoulos, MH et al. Los dos principales linajes genéticos de metapneumovirus humanos están altamente relacionados antigénicamente, y la proteína de fusión (F) es un contribuyente importante a esta relación antigénica. J.Virol. 78, 6927–6937 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowe, JE Jr. et al. Vacunas vivas del virus sincitial respiratorio del subgrupo B que son atenuadas, genéticamente estables e inmunogénicas en roedores y primates no humanos. J. infectar. Dis. 173, 829–839 (1996).

Artículo PubMed Google Académico

Taylor, G. Modelos animales de infección por virus respiratorio sincitial. Vacuna 35, 469–480 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchholz, UJ et al. Eliminación de los marcos de lectura abiertos 1 y 2 del gen M2 del metapneumovirus humano: efectos sobre la síntesis, atenuación e inmunogenicidad del ARN. J.Virol. 79, 6588–6597 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

MacPhail, M. et al. Identificación de modelos de primates y animales pequeños para la evaluación de vacunas candidatas para el metapneumovirus humano (hMPV) e implicaciones para el diseño de la vacuna hMPV. J. Gen. Virol. 85, 1655–1663 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Murphy, BR & Collins, PL Vacunas de virus vivos atenuados para virus respiratorios sincitiales y parainfluenza: aplicaciones de la genética inversa. J. Clin. investigando 110, 21–27 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, MS, Yim, KC & Blanco, J. Modelo de rata de algodón para probar vacunas y antivirales contra el virus respiratorio sincitial. antivirus química Quimioterapia. 26, 2040206618770518 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, M., Blanco, JC, Falsey, AR & Mond, J. El tratamiento con la nueva RSV Ig RI-002 controla la replicación viral y reduce el daño pulmonar en Sigmodon hispidus inmunocomprometido. Trasplante de Médula Ósea 51, 119–126 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Johnson, S. et al. Desarrollo de un anticuerpo monoclonal humanizado (MEDI-493) con potente actividad in vitro e in vivo contra el virus respiratorio sincitial. J. infectar. Dis. 176, 1215–1224 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Martin, ET, Kuypers, J., Wald, A. & Englund, JA Infecciones respiratorias virales múltiples versus únicas: carga viral y gravedad clínica de la enfermedad en niños hospitalizados. Influenza Otras Respir. Virus 6, 71–77 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Whaley, RE y col. Generación de una línea celular rentable para apoyar el aislamiento de alto rendimiento de células B humanas primarias y anticuerpos neutralizantes monoclonales. J. Immunol. Métodos 488, 112901 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

McLellan, JS Epítopos neutralizantes en la glicoproteína de fusión del virus sincitial respiratorio. actual Opinión Virol. 11, 70–75 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas, NJ, Hollenbeak, CS, Ceneviva, GD, Geskey, JM & Young, MJ Profilaxis con palivizumab para prevenir la mortalidad por el virus sincitial respiratorio después del trasplante pediátrico de médula ósea: un modelo de análisis de decisiones. J. Pediatría. hematol. oncol. 29, 227–232 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Joyce, MG et al. Estructura cristalina e inmunogenicidad de la glicoproteína de fusión estabilizada con DS-Cav1 del subtipo B del virus sincitial respiratorio. Pathog. inmune 4, 294–323 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Levin, MJ et al. AZD7442 intramuscular (Tixagevimab-Cilgavimab) para la prevención de Covid-19. N Engl J Med. 386, 2188–2200 (2022).

Biacchesi, S. et al. Recuperación de metapneumovirus humano a partir de ADNc: optimización del crecimiento in vitro y expresión de genes adicionales. Virología 321, 247–259 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bartlett, EJ et al. Las vacunas candidatas para el virus de la parainfluenza humana tipo I (HPIV1) diseñadas por genética inversa son atenuadas y eficaces en los monos verdes africanos. Vacuna 23, 4631–4646 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Munir, S. et al. Las proteínas no estructurales 1 y 2 del virus respiratorio sincitial suprimen la maduración de las células dendríticas humanas. J.Virol. 82, 8780–8796 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McLellan, JS et al. Diseño basado en la estructura de una vacuna de glicoproteína de fusión para el virus sincitial respiratorio. Ciencia 342, 592–598 (2013).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wen, X. et al. La estructura de la proteína de fusión del metapneumovirus humano con el anticuerpo neutralizante identifica un sitio antigénico de pneumovirus. Nat. Estructura. mol. Biol. 19, 461–463 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, X. et al. El diseño racional de la envoltura identifica anticuerpos monoclonales humanos ampliamente neutralizantes contra el VIH-1. Ciencia 329, 856–861 (2010).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, J. et al. Aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos a partir de células B de sangre periférica. Nat. Protocolo 8, 1907-1915 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGuire, AT et al. Los inmunógenos de Env modificados específicamente activan precursores de células B de anticuerpos de VIH-1 ampliamente neutralizantes en ratones transgénicos. Nat. común 7, 10618 (2016).

Artículo CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ y Brubaker, MA cryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida de estructuras crio-EM sin supervisión. Nat. Métodos 14, 290–296 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cianfrocco, MA, Wong-Barnum, M., Youn, C., Wagner, R. y Leschziner, A. COSMIC2: un portal científico para la determinación de la estructura mediante criomicroscopía electrónica. En Proceedings of the Practice and Experience in Advanced Research Computing 2017 on Sustainability, Success and Impact, (ed. David, H.) vol. 5, (Association for Computing Machinery, Nueva York, NY, Estados Unidos, 2017).

Sánchez-García, R. et al. DeepEMhancer: una solución de aprendizaje profundo para el posprocesamiento de volumen crio-EM. común Biol. 4, 874 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Liebschner, D. et al. Determinación de la estructura macromolecular mediante rayos X, neutrones y electrones: desarrollos recientes en Phenix. Acta Crystallogr. Secta. Estructura D. Biol. 75, 861–877 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Focha. Acta Crystallogr. Secta. D Biol. cristalogr. 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: visualización de estructuras para investigadores, educadores y desarrolladores. Ciencia de las proteínas 30, 70–82 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Croll, TI ISOLDE: un entorno físicamente realista para la construcción de modelos en mapas de densidad electrónica de baja resolución. Acta Crystallogr. Secta. Estructura D. Biol. 74, 519–530 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Schrodinger, LLC El sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 2.1.1 (Schrodinger, LLC, 2015) https://pymol.org/2/support.html?#citing.

Krissinel, E. & Henrick, K. Inferencia de ensamblajes macromoleculares del estado cristalino. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Johnson, RA, Prince, GA, Suffin, SC, Horswood, RL y Chanock, RM Infección por virus sincitial respiratorio en ratas algodoneras tratadas con ciclofosfamida. Infectar. inmune 37, 369-373 (1982).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, H. et al. Desarrollo de motavizumab, un anticuerpo ultrapotente para la prevención de la infección por virus respiratorio sincitial en el tracto respiratorio superior e inferior. J. Mol. Biol. 368, 652–665 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, Y. et al. Gravedad y mortalidad del virus respiratorio sincitial frente a la infección por influenza A en adultos hospitalizados en China. Influenza Otras Respir. Virus 14, 483–490 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lee, N. et al. Alta morbilidad y mortalidad en adultos hospitalizados por infecciones por virus respiratorio sincitial. clin. Infectar. Dis. 57, 1069–1077 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Julie McElrath por las PBMC de la cohorte de control del área de Seattle; Leo Stamatatos por el uso de espacio y equipo de laboratorio; Andrew McGuire por proporcionar células 3T3 que expresan CD40L/IL2/IL21; Ramasamy Bakthavatsalam y LifeCenter Northwest por proporcionar restos de bazo no identificados; Ursula Buchholz, Shirin Munir y Peter Collins por proporcionar RSV, HMPV, HPIV3 y HPIV1 que expresan GFP; Peter Kwong, Guillaume Stewart-Jones y Aliaksandr Druz para la expresión de HPIV3 preF; Barney Graham para la expresión de RSV preF; Theodore Jardetzky y Xiaolin Wen para la expresión de HMPV preF; Steve Voght por la corrección de pruebas del manuscrito; Paula Culver, Francesca Urselli y Laura Yates por el apoyo administrativo; los recursos compartidos de citometría de flujo de Fred Hutchinson para obtener ayuda con los instrumentos; los recursos compartidos de medicina comparativa de Fred Hutchinson para ayudar con el alojamiento de hámsters; y los miembros de Taylor Lab y Boonyaratanakornkit Lab por sus útiles debates. Los esquemas experimentales se crearon con BioRender.com. Este estudio fue apoyado por la Iniciativa de la Facultad de la División de Enfermedades Infecciosas y Vacunas (JB y JJT) y el Premio Piloto Evergreen Beyond (JB y JJT) del Fred Hutchinson Cancer Center, un acuerdo de investigación patrocinado con IgM Biosciences (JB y JJT), una nueva Premio al Investigador de la Sociedad Estadounidense de Trasplante y Terapia Celular (JB) y el Premio Amy Strelzer Manasevit del Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea (JB). Una parte de esta investigación fue financiada por U24 GM129547 del NIH y se realizó en el PNCC en OHSU y se accedió a través de EMSL (grid.436923.9), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. Se generaron más datos de microscopía electrónica utilizando el recurso compartido de microscopía electrónica del Fred Hutchinson Cancer Center, que cuenta con el apoyo parcial de P30 CA015704. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Estos autores contribuyeron por igual: Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby.

División de Vacunas y Enfermedades Infecciosas, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, EE. UU.

Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby, Matthew D. Gray, Justin J. Taylor, Marie Pancera & Jim Boonyaratanakornkit

Departamento de Inmunología y Departamento de Salud Global, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Madelyn Cabán y Justin J. Taylor

Departamento de Medicina, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Jim Boonyaratanakornkit

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

MC y MB diseñaron y realizaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. MDG realizó experimentos, analizó datos y editó el manuscrito. JVR y MP coordinaron y realizaron el análisis estructural y escribieron el manuscrito. JJT concibió el estudio, diseñó experimentos, analizó los datos y editó el manuscrito. JB concibió el estudio, diseñó y realizó los experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Justin J. Taylor, Marie Pancera o Jim Boonyaratanakornkit.

Los autores JB y JJT son inventores de solicitudes de patente presentadas por Fred Hutchinson Cancer Center dirigidas a los anticuerpos 3 × 1 y MxR. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Yaroslav Tsybovsky y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Cabán, M., Rodarte, JV, Bibby, M. et al. Anticuerpos de protección cruzada contra virus respiratorios endémicos comunes. Nat Comun 14, 798 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

Descargar cita

Recibido: 27 junio 2022

Aceptado: 01 febrero 2023

Publicado: 13 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.