La geosmina suprime el comportamiento defensivo y provoca respuestas neuronales inusuales en las abejas melíferas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3851 (2023) Citar este artículo

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La geosmina es un odorante producido por bacterias en el suelo húmedo. Se ha encontrado que es extraordinariamente relevante para algunos insectos, pero las razones de esto aún no se comprenden completamente. Aquí informamos las primeras pruebas del efecto de la geosmina en las abejas melíferas. Un ensayo de picadura mostró que el comportamiento defensivo provocado por el componente de feromona de alarma de la abeja, el acetato de isoamilo (IAA), es fuertemente suprimido por la geosmina. Sorprendentemente, la supresión, sin embargo, solo está presente en concentraciones muy bajas de geosmina y desaparece en concentraciones más altas. Investigamos los mecanismos subyacentes a nivel de las neuronas receptoras olfativas por medio de electroantenografía, encontrando que las respuestas a mezclas de geosmina e IAA son más bajas que a IAA puro, lo que sugiere una interacción de ambos compuestos a nivel del receptor olfativo. Las imágenes de calcio del lóbulo antenal (AL) revelaron que las respuestas neuronales a la geosmina disminuyeron con el aumento de la concentración, lo que se correlacionó bien con el comportamiento observado. El modelado computacional de la transducción y codificación de olores en el AL sugiere que una activación más amplia de los tipos de receptores olfativos por parte de la geosmina en combinación con la inhibición lateral podría conducir a las respuestas no monótonas observadas de aumento-disminución a la geosmina y, por lo tanto, subyacen a la especificidad de la respuesta conductual a la geosmina. bajas concentraciones de geosmina.

La geosmina es un compuesto mohoso con olor a tierra producido por múltiples microorganismos de varios clados, como cianobacterias, actinobacterias (p. ej., Streptomyces sp.), protozoos, mohos y hongos1,2. Las actinobacterias (incluido Streptomyces) están ampliamente asociadas con los nidos de himenópteros, que probablemente protegen de los patógenos gracias a su producción natural de antibióticos3,4,5. Un estudio reciente encontró que las reinas de las hormigas de fuego (Solenopsis invicta) preferentemente comenzaron nuevos nidos en suelos ricos en actinobacterias. Esta atracción estuvo mediada en parte por la geosmina y resultó en una mayor tasa de supervivencia de la reina6. La geosmina también es ecológicamente importante para otros insectos, como la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y el mosquito Aedes aegypti. Sin embargo, evoca respuestas dramáticamente diferentes en esas especies. Geosmin provoca una fuerte aversión en D. melanogaster, incluso en presencia de compuestos atractivos7,8. Esto podría ser para evitar la oviposición en frutos enmohecidos e inadecuados8, o para proporcionar un mejor contraste con los frutos maduros caídos, haciendo así que la búsqueda sea más eficiente9. En Ae. aegypti, por el contrario, la geosmina es un fuerte atrayente10. Esto es probable porque indica la presencia de suelo húmedo, en el que se pueden poner los huevos. De hecho, la geosmina también es conocida por ser uno de los principales componentes de Petrichor, "el olor a tierra mojada"2.

En el primer centro cerebral de procesamiento olfativo de los insectos, el lóbulo antenal (LA), la mayoría de los olores provocan un patrón combinatorio de respuestas glomerulares11,12. Sin embargo, algunos olores, a menudo con una gran relevancia biológica (por ejemplo, las feromonas sexuales), solo activan un único glomérulo. Cuando esta respuesta se procesa de forma independiente también en centros cerebrales superiores, lo que da como resultado respuestas conductuales estereotipadas, el circuito se denomina línea etiquetada12. La geosmina es uno de los pocos compuestos que activan solo un glomérulo en D. melanogaster y Ae. Mosquitos Aegypti8,10. En las moscas, su procesamiento se segrega funcionalmente en los centros cerebrales superiores, donde tiene prioridad sobre otras señales olfativas para desencadenar un comportamiento de evitación8.

A pesar de la relevancia ecológica de la geosmina en muchas especies de insectos, las respuestas fisiológicas y de comportamiento a este olor no se han investigado previamente en la abeja melífera Apis mellifera. Aquí, proporcionamos los primeros datos para abordar esta pregunta. Este trabajo fue motivado por la pregunta de si la geosmina, que es una pista olfativa de la inminente lluvia de verano para los humanos, también podría ser un indicador meteorológico para las abejas melíferas13. Si es así, debería modular el comportamiento de las abejas, ya que se han informado efectos dependientes del clima en una amplia gama de comportamientos de las abejas, también para las actividades dentro de la colmena14. Los cambios de comportamiento en los recolectores incluso parecen anticipar los cambios del clima15.

Rara vez se ha investigado una posible influencia en el comportamiento defensivo. Aunque existe alguna evidencia de que el escozor aumenta en condiciones cálidas y húmedas16,17, los informes de los apidólogos no necesariamente confirman estas observaciones. Decidimos investigar la influencia de la geosmina en el comportamiento defensivo en este contexto.

Las abejas melíferas defienden su colonia picando a posibles intrusos, un comportamiento que se estimula en presencia de la feromona de alarma liberada por otros miembros de la colonia18. Probamos este comportamiento en el laboratorio utilizando un ensayo de picaduras bien establecido19. Además, buscamos correlatos neuronales para el comportamiento a nivel de las neuronas receptoras olfativas a través de electroantenografía y a nivel de las neuronas de proyección del lóbulo antenal a través de imágenes de calcio de dos fotones in vivo20 de la actividad provocada por geosmina. Finalmente, utilizamos un modelo de red neuronal de picos para investigar cómo las respuestas neuronales parcialmente inusuales observadas se relacionan con la comprensión actual del sistema olfativo de la abeja.

El comportamiento de picadura de una díada de abejas hacia un maniquí giratorio negro, presentado dentro de una arena, fue monitoreado bajo la exposición a diferentes estímulos de olor. En un grupo de control, las abejas fueron expuestas a aceite mineral puro. En este grupo, en el 15% de los ensayos, al menos una de las dos abejas mostró un comportamiento de picadura contra el maniquí (Fig. 1a, Película complementaria 1). Si las abejas estaban expuestas a la geosmina dentro de la arena, no se observó ningún efecto sobre la frecuencia del comportamiento de picadura. Si, en cambio, las abejas estuvieran expuestas a acetato de isoamilo (IAA, a una concentración de 10–1), un compuesto activo de la feromona de alarma de las abejas21, el comportamiento de picadura aumentó significativamente al 50% de picadura (t(47) = 3,3, p = 0,002 ) como se esperaba (Fig. 1b).

Una baja concentración de geosmina evita el reclutamiento en el comportamiento de picadura por parte de IAA. ( a ) Esquema del ensayo de comportamiento. A una pareja de abejas se le presentó un maniquí giratorio, que podían elegir entre picar o no. Las flechas rojas indican los puntos de entrada del flujo de aire que lleva los olores a la arena. (b) Frecuencia de ensayos en los que al menos una de las abejas exhibió un comportamiento de picadura (n = 48 díadas de abejas por grupo). MO: aceite mineral (control de disolvente); Geo 10−x: geosmin en concentración 10−x; IAA 10–1: acetato de isoamilo a la concentración 10–1. Los grupos etiquetados con la misma letra no son significativamente diferentes entre sí (GLM, corregido para comparaciones múltiples con un procedimiento FDR).

Cuando las abejas fueron expuestas a una mezcla de IAA y una baja concentración de geosmina (10–6), se observaron claros signos de una interacción entre ambos estímulos con una probabilidad de picadura del 25%, una reducción significativa de la frecuencia de este comportamiento en comparación con abejas expuestas solo a IAA (t(47) = 2,4, p = 0,02). Ya no hubo diferencia significativa con respecto al control de aceite mineral (t(47) = 1.1, p = 0.27, Fig. 1b).

Sin embargo, cuando la concentración de geosmina en la mezcla fue de 10–3, se observó escozor en el 40 % de los casos, lo que no fue significativamente diferente del comportamiento de las abejas estimuladas solo con IAA (t(47) = 0,6, p = 0,57). De hecho, esta frecuencia de picaduras fue nuevamente significativamente mayor que para las abejas de control (t (47) = 2.9, p = 0.006), lo que sugiere que el comportamiento fue impulsado por la respuesta a IAA en este caso (Fig. 1b).

Comenzamos a buscar los correlatos neuronales del efecto conductual de Geosmin combinado con IAA en la periferia del sistema olfativo, apuntando a las neuronas receptoras olfativas (ORN) en las antenas. La electroantenografía mide un cambio de voltaje entre los electrodos en cada extremo de la antena en respuesta a la exposición a un olor. Esta señal, un registro de potencial de campo local, tiene una amplitud proporcional a la suma de la actividad provocada en todos los ORN. En nuestro experimento, las antenas de las abejas melíferas (n = 24) se expusieron a Geosmin en 4 concentraciones que varían logarítmicamente de 10–6 a 10–3, a dos concentraciones de IAA: 10–3 y 10–1, y a mezclas de ambos olores. en todas estas concentraciones. Un ejemplo de las señales obtenidas de una sola abeja en respuesta a los diferentes estímulos se muestra en la Fig. 2a. Sin embargo, la magnitud de estas señales se ve afectada por varios factores: la edad y el estado del animal, la conductividad del electrodo, la ubicación del electrodo cerca de ORN particulares, la ubicación del suelo y otros factores. Para controlar cualquier diferencia entre individuos en las magnitudes de respuesta, primero se normalizó la respuesta de cada abeja para cada concentración de IAA solo (0, 10–3, 10–1) y luego se calcularon los promedios para todas las abejas. y los análisis estadísticos se realizaron para medidas repetidas de respuestas EAG (prueba de Friedman seguida de comparaciones múltiples de Dunn). Para resaltar las diferencias estadísticas entre las medias normalizadas, también mostramos los datos sin procesar para cada abeja en la Fig. 1 complementaria.

Respuestas de las neuronas receptoras olfativas. ( a ) Ejemplo de curvas de respuestas de EAG de una sola abeja a todos los olores y combinaciones. La línea negra debajo de la grabación indica la presencia del estímulo (2 s). ( b ) Media de la amplitud de respuesta normalizada (± SEM) a diferentes concentraciones de geosmina. ( c ) Media de la amplitud de respuesta normalizada (± SEM) a diferentes concentraciones de geosmina combinada con IAA 10–3. ( d ) Media de la amplitud de respuesta normalizada (± SEM) a diferentes concentraciones de geosmina combinada con IAA 10–1. IAA 10-x: Acetato de isoamilo 10-x (vol/vol); Geo 10-x: Geosmin 10-x (vol/vol); Las estadísticas son de una prueba de Friedman seguida de comparaciones múltiples de Dunn con Control, IAA3 e IAA1, en B, C, D respectivamente: ****p < 0,0001; *** p < 0,001; ** p < 0,01; * p < 0,05. Las respuestas de amplitud individuales de todas las abejas probadas (n = 24) se representan en la figura complementaria 1.

Los resultados mostraron una respuesta significativamente diferente del control de aceite mineral a una concentración de geosmina de 10–4 o superior. Las señales siguieron el aumento de amplitud exponencial típico en respuesta a concentraciones crecientes (Fig. 2b, Fig. 1d complementaria). Las respuestas a las concentraciones más bajas de geosmina (10-5 y 10-6) no fueron significativamente diferentes del control, probablemente porque la diferencia de señal estaba por debajo del límite de resolución de este método. Sin embargo, para una concentración de 10–5 de geosmina, se puede observar una clara tendencia a aumentar la amplitud en la mayoría de los casos (Fig. 2a, b, Fig. 1a, d complementaria).

La estimulación con IAA a una concentración de 10–3 indujo una fuerte respuesta (Fig. 2a), que pareció reducirse en presencia de Geosmin 10–6, aunque el efecto no es significativo (Fig. 2c, Supl. Fig. 1b,e) . Con Geosmin en concentraciones de 10–4 o más, las señales en respuesta a las mezclas aumentaron significativamente en comparación con la estimulación solo con IAA (Fig. 2c, Fig. 1b, e complementaria). Cuando las antenas fueron expuestas a mezclas con IAA a una concentración de 10–1, las señales mostraron una reducción cuando estaba presente una concentración de Geosmin de 10–5 y en este caso la diferencia fue significativa con respecto a IAA (p = 0.01, Fig. 2d, Fig. complementaria 1c,f). Esta diferencia se puede apreciar mejor en la Fig. 1c complementaria, donde se ilustran las respuestas individuales. Aquí, el 75% de las abejas (18 de 24) muestran una respuesta reducida en presencia de Geosmin en una concentración de 10–5 en comparación con IAA puro en una concentración de 10–1 (individuos representados con líneas azules).

Los resultados mostraron que para la concentración probada de comportamiento de IAA (10–1), las amplitudes de respuesta a las mezclas fueron más bajas que la suma de las respuestas a los compuestos individuales (líneas discontinuas verdes en la Fig. 1f complementaria). En el caso de una concentración de 10–5 geosmin, vemos que esta supresión se refleja en una reducción significativa de la respuesta en comparación con IAA puro. Sin embargo, para la concentración de geosmina probada según el comportamiento, la diferencia no fue significativa. Esto podría deberse en parte al umbral de detectabilidad impuesto por el método, es decir, la estimulación con geosmina sola en las concentraciones más bajas no provocó una señal de respuesta detectable (Fig. 2b), y de la misma manera, cuando se combinó con IAA 10–1 (concentración probada según el comportamiento), geosmin 10–6 no tuvo un efecto significativo (Fig. 2d). Además, el efecto observado de 10–5 de concentración de geosmina en el EAG encaja con el efecto observado de 10–6 de concentración de geosmina en las respuestas conductuales, lo que sugiere una posible correlación de las respuestas ORN con el fenómeno observado a nivel conductual. Sin embargo, si los efectos conductuales ya se produjeron a nivel del receptor, esta interacción también debería manifestarse al seguir la transducción de la señal hasta el lóbulo antenal.

Para rastrear la actividad inducida por el olor en el siguiente nivel de procesamiento, realizamos imágenes de calcio de las neuronas de proyección en los lóbulos antenales de las abejas melíferas. Estas neuronas transmiten información desde los AL a los centros cerebrales de orden superior. Los experimentos de formación de imágenes se realizaron en 14 abejas expuestas a los mismos olores a las mismas concentraciones que en el ensayo de comportamiento. El cambio en la fluorescencia inducida por el estímulo del olor se registró en 19 glomérulos (Fig. 2 complementaria). Cuando se promediaron durante el período de estímulo de 3 s, estas señales glomerulares mostraron patrones de respuesta altamente estereotípicos en las abejas (la Fig. 3c muestra la mezcla de geosmina IAA como ejemplo).

Respuestas glomerulares. ( a ) Curvas de respuesta glomerular media a Geosmin puro en dos concentraciones diferentes, 10–6 y 10–3, y a tres compuestos de olor floral; 1-nonanol, acetofenona y 3-hexanol en concentración 5∙10–3 para 19 glomérulos (Fig. 2a complementaria) promediados sobre todos los glomérulos identificados en 14 abejas. La estimulación del olor comenzó después de 3 s y duró 3 s, marcada por líneas blancas discontinuas. El cambio de fluorescencia inducido por calcio en porcentaje está codificado por colores. Las diferencias entre las respuestas a Geosmin 10–6 y 10–3 fueron significativas para el glomérulo 19 (t(2) = -12,1, p = 0,013) y el glomérulo 36 (t(13) = -2,2, p = 0,047) (b) Curvas de respuesta glomerular media al compuesto de feromona de alarma acetato de isoamilo (IAA) a la concentración 10-1 y a las mezclas de IAA con las 2 concentraciones de geosmina. La escala de colores es diferente, dadas las respuestas más fuertes a 10–1 IAA. Las diferencias entre las respuestas a IAA puro y a IAA + Geosmin 10–6 son significativas para el glomérulo 49 (t(13) = -2,6, p = 0,043) y el glomérulo 52 (t(6) = -3,3, p = 0,02), entre IAA e IAA + Geosmin 10–3 para el glomérulo 43 (t(6) = -3,3, p = 0,02), y entre IAA + Geosmin 10–6 e IAA + Geosmin 10–3 para el glomérulo 52 (t(6) = 3,2 , p = 0,028). ( c ) Amplitudes de respuesta glomerular promediadas en el tiempo a la mezcla de IAA y 10–6 geosmina en cada abeja, que muestran la estereotipia de la respuesta. El gris representa casos en los que los glomérulos no se identificaron claramente.

Las curvas de respuesta temporal promedio muestran respuestas muy diferentes a 4 olores puros (Fig. 3a): geosmina en las mismas dos concentraciones que se usaron en las pruebas de comportamiento, 10–6 y 10–3 en aceite mineral, y los tres olores florales 1 -nonanol, acetofenona y 3-hexanol, todos en una concentración de 5∙10–3 en aceite mineral. La geosmina en concentración 10–6 provoca respuestas en varios glomérulos, el espectro resulta ser más amplio que el del olor floral. Muestra respuestas excitatorias tónicas en 3 glomérulos (19, 28, 36), respuestas excitatorias fásicas en otros 4 (25, 29, 35, 49) e inhibición en al menos 3 glomérulos (42, 48, 60), mientras que la floral los olores provocan respuestas comparables en sólo hasta 4 glomérulos. Sorprendentemente, las respuestas a la geosmina desaparecen casi por completo a la concentración 1000 veces mayor de 10–3, lo que sugiere una dependencia de concentración no monótona en el patrón de respuesta de la neurona de proyección (PN). Las diferencias entre Geosmin 10–6 y 10–3 son significativas para el glomérulo 19 (t(2) = − 12,1, p = 0,013) y el glomérulo 36 (t(13) = − 2,2, p = 0,047). Los valores medios sugieren una diferencia también en el glomérulo 28, pero debido a la gran fluctuación entre sujetos, el efecto no es significativo (t(13) = − 1,5, p = 0,17).

A continuación, las abejas fueron estimuladas con el compuesto de feromona de alarma IAA nuevamente a la misma concentración que en el experimento de comportamiento de 10–1, que es al menos 20 veces mayor que los otros estímulos y, en consecuencia, provoca respuestas mucho más fuertes. Además de IAA, también se probaron sus mezclas con geosmina. Notablemente, todos los glomérulos que responden a IAA parecen estar respondiendo también a geosmin. También en las mezclas, las contribuciones de geosmina son claramente visibles a una concentración de 10–6 pero desaparecen casi por completo a una concentración de 10–3. Las diferencias entre IAA puro e IAA + Geosmin 10–6 son significativas para el glomérulo 49 (t(13) = -2,6, p = 0,043) y el glomérulo 52 (t(6) = − 3,3, p = 0,02). Los valores medios sugieren una diferencia también en el glomérulo 19, pero el glomérulo se identifica claramente solo en tres abejas (Fig. 3c), por lo que el efecto no es significativo (t(2) = − 2,5, p = 0,14). Estas diferencias desaparecen para la mezcla IAA + Geosmin 10–3. La respuesta a esta mezcla es significativamente diferente de la respuesta a IAA puro para el glomérulo 43 (t(6) = − 3,3, p = 0,02). Las respuestas a IAA + Geosmin 10–6 e IAA + Geosmin 10–3 difieren significativamente para el glomérulo 52 (t(6) = 3,2, p = 0,028).

No se detectó una interacción significativa entre la geosmina y el IAA y las respuestas a la mezcla parecen ser exactamente la suma de las respuestas de los compuestos individuales. Por lo tanto, no pudimos confirmar directamente la interacción entre los dos olores a nivel de las antenas o en el AL. Sin embargo, tampoco pudimos excluir tales interacciones ya que solo el 12% de todos los glomérulos eran ópticamente accesibles. Teniendo en cuenta solo las señales de PN medidas, la evidencia hasta ahora apunta a interacciones entre IAA y geosmina que ocurren solo en centros cerebrales de nivel superior, como el cuerpo de hongo (MB) o el cuerno lateral (LH).

Si bien es bien sabido que las respuestas de las NP en función del tiempo son complejas y no monótonas y que la respuesta de las NP individuales en función de la concentración puede aumentar o disminuir22, parece inusual que las respuestas fásicas a la geosmina en todas los glomérulos observados parecen disminuir para concentraciones más altas y prácticamente desaparecen para una concentración de 10–3. Hemos construido un modelo de red neuronal de picos computacionales del sistema olfativo temprano de las abejas para investigar si esta y nuestras otras observaciones son consistentes con nuestra comprensión actual del sistema. El modelo se basa en trabajos anteriores23,24 y describe los receptores olfativos con un proceso de unión y activación en dos etapas25. Los receptores olfativos luego excitan las neuronas receptoras olfativas (ORN), que a su vez excitan las neuronas de proyección (PN) y las neuronas locales (LN) en el lóbulo antenal. Todos los ORN con el mismo tipo de receptor se proyectan al mismo glomérulo26. Los LN inhiben los PN y los LN en todos los demás glomérulos. El circuito se ilustra en la Fig. 4a. El modelo tiene 160 tipos de receptores y, por lo tanto, glomérulos, y 5 PN y 25 LN por glomérulo, lo que refleja las mejores estimaciones actuales. Simulamos 60 ORN de cada tipo, lo que significa que cada ORN simulado representa alrededor de 10 ORN en la realidad. Se dan más detalles en los Métodos. La figura 4c muestra un seguimiento de datos de ejemplo de las simulaciones. Los olores se introdujeron como un cambio gradual de cero a una concentración constante durante 3 s (barra gris) y luego se volvieron a establecer en 0. La activación de OR comienza inmediatamente después del inicio del olor y luego conduce a picos en ORN, seguida con un retraso apenas perceptible por PN y picos LN. Se puede distinguir un indicio de la adaptación de la tasa de picos en los ejemplos ORN y LN, pero esto se vuelve más pronunciado para tasas de picos más altas. Las PN no tienen adaptación de tasa de picos en este modelo.

Modelo Computacional. (a) Diagrama de circuito del modelo. Los ORN excitan PN y LN en el AL según su tipo de receptor (colores). Los LN también reciben excitación de los PN dentro del mismo glomérulo. Los LN inhiben los PN y los LN en todos los demás glomérulos, pero no en los suyos. (b) Respuesta de las ORN a diferentes mezclas de los olores "IAA" y "Geosmin". (c) Datos de ejemplo para una respuesta de olor típica. La barra en el panel superior indica la exposición al olor. Para ORN, PN y LN, se muestra el rastro de una neurona de ejemplo arbitraria conectada al glomérulo que responde con mayor fuerza. Se agregaron picos a las trazas de potencial de membrana LIF como líneas verticales para mayor claridad. ( d ) Respuestas promediadas en el tiempo de las PN (función de densidad de picos SDF) en el glomérulo de respuesta más fuerte en respuesta a 100 olores simulados diferentes presentados durante 3 s cada uno y en diferentes concentraciones. (e) Mapas de calor que ilustran la actividad media de PN en cada uno de los glomérulos en respuesta a "Geosmin", "IAA" y mezclas de los dos olores.

Al inspeccionar las grabaciones de EAG y los resultados de las imágenes de PN, planteamos la hipótesis de que las respuestas decrecientes inusuales en todos los glomérulos observados para concentraciones más altas de Geosmin podrían deberse a la inhibición local mediada por LN en el AL. Además, el comportamiento no monótono no se ha informado ampliamente, por lo que razonamos que Geosmin debe tener una propiedad particular que lo hace susceptible a un exceso de inhibición. Exploramos las propiedades de las respuestas al olor, incluida la sensibilidad (η en el modelo OR), la amplitud de la respuesta entre los tipos de receptores (σ en el modelo OR) y la activación (k2 en el modelo OR). Encontramos que la amplitud de la respuesta fue el factor decisivo que condujo a relaciones respuesta-concentración no monótonas en la NP. La Figura 4d ilustra este resultado. Generamos 98 olores con una distribución aleatoria de propiedades de respuesta y dos con otras más específicas, un olor que tenía un perfil de respuesta muy amplio, que identificamos con Geosmin, y un olor que tenía un perfil de ancho medio pero una activación muy alta que identificamos con IAA. Como se puede ver en la Fig. 4d, "Geosmin" muestra una respuesta no monótona en función de la concentración, mientras que "IAA" es esencialmente monótona. La muestra aleatoria de otros olores difiere en su comportamiento pero tiene en su mayoría curvas de respuesta sigmoideas típicas y crecientes. Descubrimos que la monotonicidad (consulte "Métodos" para obtener una definición formal) o la falta de respuestas de olor se correlaciona fuertemente con el ancho del perfil de olor (Figuras complementarias 3, 4, 5, 6). La intuición detrás del comportamiento no monótono de los olores con respuestas inusualmente amplias es que al aumentar la concentración, se activan más tipos de OR, lo que aumenta la cantidad de glomérulos involucrados y, por lo tanto, la inhibición global además del aumento de la inhibición debido a una mayor activación de OR. tipos que ya están activos. Al mismo tiempo, la excitación de cada glomérulo aumenta solo de acuerdo con la curva de respuesta sigmoidea del tipo OR correspondiente. Cuando el perfil de respuesta es amplio, los aumentos combinados de inhibición pueden compensar el aumento de excitación y la respuesta general de PN disminuye. Para perfiles de respuesta más estrechos, el exceso de inhibición de los tipos OR recién reclutados es menor y la respuesta PN sigue aumentando.

Luego preguntamos si también podemos reproducir las interacciones observadas de geosmina e IAA que se ven en los datos de EAG (Fig. 2). Aquí, interpretamos el número total de picos de ORN en todos los tipos de OR como un indicador sensible de una medición de EAG y razonamos que es probable que las interacciones se deban a efectos de mezcla sintópica en los receptores. Con esto en mente, Geosmin conduciría a la inhibición de las respuestas de IAA en la antena si su activación fuera menor que la de IAA. Por lo tanto, establecimos la tasa de activación k2 de "Geosmin" más baja que la de "IAA" y generamos recuentos de picos de ORN para mezclas de "Geosmin" e "IAA". A través de la exploración manual, encontramos que para una relación de aproximadamente 1:3 (k2Geo = 0,03 kHz, k2IAA = 0,1 kHz) las respuestas exhibieron efectos de supresión que mostraron similitudes con las observaciones experimentales (Figs. 2b–d, 4b). La relación cuantitativa exacta a diferentes relaciones de concentración depende, además de la relación k2, también de la superposición de los perfiles de activación OR "Geosmin" e "IAA". Probamos esto generando "Geosmin" e "IAA" como perfiles de respuesta gaussiana con una distancia específica entre sus máximos. Para distancias pequeñas (superposición grande), domina la supresión sintópica de las respuestas IAA, y para distancias grandes (superposición pequeña) las respuestas son más aditivas (Fig. 7 complementaria). Si bien el modelo reproduce en principio la supresión de las respuestas IAA por parte de la geosmina, no pudimos reproducir completamente las respuestas más o menos constantes que se ven en la Fig. 2d con este esquema y sin perder la coincidencia del comportamiento del modelo y los experimentos en el nivel del AL (ver arriba). Sin embargo, es probable que con otras formas de generar perfiles de respuesta superpuestos o, de hecho, distintos de los perfiles de respuesta gaussiana, las observaciones experimentales puedan replicarse más de cerca.

Finalmente, preguntamos si los olores "Geosmin" e "IAA" generados para reproducir el comportamiento no monotónico en las PN y las propiedades de respuesta subaditivas en el EAG producirían respuestas de PN similares a los datos de imágenes de calcio de la actividad de la PN en la AL. La Figura 4e muestra los patrones de respuesta simulados de las PN en respuesta a Geosmin en 10–6, 10–3 (compárese con la Fig. 3a), IAA en 10–1 y las mezclas de IAA en 10–1 y Geosmin en 10–6 y 10-3 (compárese con la figura 3b). En general, las respuestas se parecen a los datos experimentales con una respuesta moderada a "Geosmin" 10–6, que esencialmente desaparece en 10–3. En las mezclas, agregar "Geosmin" 10–6 a IAA 10–1 casi no tiene efectos visibles mientras que agregar "Geosmin" 10–3 parece agudizar un poco el perfil de respuesta, donde los glomérulos fuertemente activados por "IAA" y "geosmin" obtienen los glomérulos aún más activados y débilmente activados están levemente deprimidos, presumiblemente debido a la inhibición global adicional por parte de los LN. Por inspección visual, parecen estar presentes efectos similares en los datos experimentales (Fig. 3b), pero no identificamos efectos estadísticamente significativos.

Si bien la defensa de la colonia es de vital importancia para las abejas melíferas, también es muy costosa. Su aguijón con púas permanece incrustado en materiales elásticos y se arranca del abdomen cuando la abeja se aleja. Así, la decisión de responder a la feromona de alarma picando debe estar estrictamente regulada para evitar pérdidas innecesarias de mano de obra. Hay varias pruebas de que esto es así: la respuesta de las feromonas de alarma disminuye cuando su concentración es demasiado alta27, cuando aumenta el tamaño del grupo28 y en presencia de compuestos apetitivos19. Estas señales adicionales pueden indicar a las abejas que la amenaza ya está siendo atendida o que este no es el contexto adecuado para una respuesta defensiva. Aquí, informamos otro caso más de tal supresión de la respuesta de feromonas de alarma, provocada por la presencia de geosmina (Fig. 1). Curiosamente, probamos las abejas con 2 concentraciones de geosmina y solo encontramos este efecto inhibidor cuando usamos la más baja. Los efectos de los olores dependientes de la concentración en el comportamiento se han informado antes, por ejemplo, las hormigas tejedoras exhiben una serie de comportamientos cuando se acercan (y, por lo tanto, perciben un aumento en la concentración) a una fuente que libera 1-hexanol, un componente de su propia feromona de alarma29. Recientemente, se han informado respuestas conductuales no monótonas al propio IAA en las abejas melíferas27. Más precisamente, la frecuencia de picaduras de las abejas individuales analizadas en el mismo ensayo de comportamiento aumentó con la concentración de IAA hasta 2.5∙10–1, pero luego disminuyó cuando se usaron concentraciones más altas. Además de la fuerte superposición observada entre los glomérulos activados por geosmina e IAA, una hipótesis podría ser que la activación aditiva por geosmina cambiaría la respuesta conductual hacia el rango decreciente de esta curva de dosis-respuesta de IAA. Si bien esta hipótesis debe probarse más a fondo, creemos que es poco probable ya que la disminución en el comportamiento de picaduras solo aparece en concentraciones muy altas de IAA, lo que presumiblemente requiere activaciones mucho más fuertes que las registradas aquí.

Previamente se observó una modulación similar del comportamiento defensivo, en el que la respuesta de escozor a la feromona de alarma se redujo mediante la adición de otro olor19. Este efecto fue específico de los compuestos florales con valor apetitivo. ¿La geosmina indica alimento para las abejas melíferas? Esta hipótesis podría probarse midiendo la frecuencia de extensión espontánea de la probóscide en respuesta a este compuesto en un estudio futuro19. Se han encontrado bacterias Streptomyces en flores y pueden proteger a las abejas contra patógenos30. Si bien la gran mayoría de las especies de Streptomyces pueden producir geosmina31, la detección real de geosmina dentro del ramo floral, sin embargo, solo se ha informado en unas pocas especies de cactus32. Queda por verificar si este compuesto podría atraer abejas a las flores y, por lo tanto, participar directamente en la mediación de interacciones mutuas. Otra posibilidad interesante sería que la geosmina, aunque no esté presente específicamente en las flores, señale un aumento general en la disponibilidad de néctar: ​​de hecho, la producción de néctar aumenta después de la lluvia33 cuando las bacterias del suelo también liberan geosmina. Por lo tanto, la presencia de geosmina podría desencadenar respuestas de búsqueda de alimento en las abejas melíferas, al igual que los compuestos florales apetitosos.

La geosmina es un compuesto ecológicamente relevante que provoca atracción o repulsión en varias especies de artrópodos, incluidas moscas7,8, mosquitos5 y colémbolos34. Aunque su función ecológica sigue siendo un misterio en el caso de las abejas melíferas, nuestros datos sugieren que puede ser igualmente relevante para este importante polinizador y vale la pena investigar más a fondo.

Los resultados de la electroantenografía sugieren que la dependencia de la concentración no monótona del comportamiento no se deriva de una sensibilidad anómala de los receptores a la geosmina, ya que la amplitud de EAG muestra una curva dosis-respuesta típica creciente para estímulos con olor puro (Fig. 2b). Sin embargo, dado que solo se observó un efecto de comportamiento en las mezclas entre geosmina e IAA, lo más interesante son las posibles interacciones entre estos dos estímulos. De hecho, en comparación con una suma lineal esperable de las amplitudes de respuesta de olor puro35, la amplitud de respuesta a la mezcla binaria no muestra este claro aumento con la concentración. La mezcla de geosmina con una baja concentración de IAA muestra una tendencia a un aumento reducido de la señal con el aumento de la concentración de geosmina (Fig. 2c). Para la alta concentración de IAA (Fig. 2d), el efecto se vuelve significativo: la adición de geosmina 10–5 provoca una disminución significativa en la señal, y el aumento significativo esperado no es observable hasta una concentración de geosmina de 10–3. Las curvas de dosis-respuesta en las que una mayor concentración no necesariamente produce un aumento en la amplitud de la respuesta se han observado previamente en mediciones de EAG en abejas melíferas, y estas también fueron respuestas a mezclas de olores36.

Una interacción de geosmin e IAA está en línea con la señal de comportamiento, donde el efecto de geosmin en la picadura inducida por IAA fue significativo para geosmin 10–6 pero desapareció para geosmin 10–3.

El mecanismo subyacente de esta interacción podría ser el enmascaramiento del IAA por la geosmina a nivel de los receptores, efecto que ha sido informado37. Curiosamente, en este trabajo fue el IAA el que había sido identificado como un fuerte agente enmascarante, pero también se demostró que podía enmascararse con algunos olores37. Un requisito para el enmascaramiento es la sensibilidad de los receptores a ambos olores. Siendo la señal EAG la suma de la actividad en gran parte de las 60.000 ORNs, no permite identificar claramente mecanismos de enmascaramiento limitados a una pequeña fracción de ORNs. Para obtener más información sobre las posibles interacciones, realizamos imágenes de calcio de las respuestas de olor a nivel del lóbulo antenal.

Un requisito para una interacción entre ambos olores fue confirmado por los mapas de respuesta de las neuronas de proyección glomerular. Aunque solo un subconjunto de 19 de 160 glomérulos (Fig. 1 complementaria) pudo identificarse consistentemente en varios sujetos, se encontró que todos los glomérulos que fueron activados por IAA también lo fueron por geosmin 10–6 (Fig. 3).

Otro hallazgo sorprendente de las imágenes de calcio fue una dependencia no monotónica de las respuestas de las neuronas de proyección a la concentración de geosmina (Fig. 3a, b). Usando las mismas concentraciones que en los estudios de comportamiento, las respuestas amplias y fuertes a la geosmina 10–6 desaparecieron casi por completo para 10–3. Esto nuevamente está en línea con los datos de comportamiento. Sin embargo, tal dependencia de concentración no monótona parece ser muy rara. A nivel del lóbulo antenal no se había reportado antes en abejas. Un trabajo en polillas muestra tales respuestas a los componentes de las feromonas a partir de registros electrofisiológicos en el LA, sin embargo, el tipo de neuronas sigue sin determinarse38. Al nivel de la entrada del cuerpo del hongo abeja melífera, los botones de PN mostraron dependencias de concentración muy variables39, aumentos y disminuciones monótonas, así como cambios no monótonos. Los autores sugirieron inhibición a nivel de los botones. Otro trabajo en polillas encontró solo aumentos monotónicos a nivel de LA en las dendritas PN pero a nivel de los somas PN también respuestas no monotónicas40. El mecanismo subyacente sugerido fue la inhibición postsináptica. Además de esas dos posiciones en las que la inhibición podría crear tal cambio en la dependencia de la concentración, nuestros datos ahora sugieren que también la inhibición dentro del lóbulo antenal podría tener un efecto.

La obtención de imágenes de la respuesta a las mezclas de IAA y geosmina confirmó la dependencia no monotónica de la concentración de geosmina también en esta condición. Sin embargo, no se observó una interacción de IAA y geosmina en el subconjunto de imágenes de glomérulos, las mezclas provocaron una respuesta que parece ser la suma exacta de las respuestas de olor puro de ambos compuestos (Fig. 3b). Esto sugiere dos escenarios posibles: o las interacciones varían entre los glomérulos y no son visibles en el subconjunto que pudimos visualizar, o nuestras observaciones en la señal de EAG no se deben a una interacción de ORN, y tampoco ocurren interacciones al nivel de la lóbulo antenal donde se identifican los olores, sino en los centros cerebrales superiores como el cuerpo de hongo y el cuerno lateral donde se extrae la valencia de los olores41.

Un último resultado importante de las imágenes de calcio es la observación de un amplio mapa de respuesta que provoca la geosmina, que prueba la codificación combinatoria de este olor en contraste con los resultados en moscas de la fruta8 y mosquitos10 donde la respuesta se limitó a un solo glomérulo, que corresponde a el mecanismo de codificación complementario de una línea etiquetada42. De hecho, los estudios de la evolución de los receptores olfativos sugieren que es probable que exista una variación en los modos de codificación entre especies43. El ancho del espectro de receptores que activó la geosmina parece de hecho más amplio que el de los olores florales que se tomaron imágenes en comparación (Fig. 3a). Esta observación resultó crucial para el siguiente intento de investigar cómo podría surgir la dependencia de la concentración invertida del procesamiento de las señales de entrada regulares en la red del lóbulo antenal.

Los desconcertantes resultados de una dependencia inversa de la concentración de la respuesta de geosmina en las neuronas de salida del lóbulo antenal, así como la interacción entre geosmina e IAA a nivel de las neuronas receptoras olfativas, se contextualizaron con la ayuda de un modelo computacional del receptor olfativo. neuronas y el AL. Hemos demostrado que tal patrón de respuesta puede surgir como resultado de las propiedades específicas de las respuestas del receptor y un equilibrio específico de acoplamiento inhibidor-excitador en el AL. La persistencia de algunas respuestas fásicas débiles a la concentración más alta de geosmina sugiere que la inhibición, más que la desaparición del impulso excitatorio, es responsable del cambio de señal. Esto se reproduce en el modelo en el que las respuestas fásicas débiles permanecen en concentraciones más altas porque la inhibición de las PN de las interneuronas locales siempre llega un poco más tarde que la excitación directa de las neuronas sensoriales. La respuesta casi nula de la geosmina para concentraciones más grandes puede ser sorprendente a primera vista, ya que al mismo tiempo otros odorantes tienen perfiles de respuesta perfectamente normales con respuestas crecientes o saturantes con concentraciones crecientes y el patrón de conexiones inhibidoras es, por supuesto, una propiedad del circuito, independiente de la olor. Con nuestro modelo computacional, hemos demostrado que, contrariamente a las expectativas intuitivas, el mismo circuito inhibitorio puede conducir a comportamientos de respuesta cualitativamente diferentes en función de la amplitud, la sensibilidad y la activación del conjunto de ORN en respuesta a diferentes odorantes. Como se ilustra en las Figs. complementarias. 3, 4, 5, dependiendo de la amplitud de la activación a través del reservorio del receptor, los perfiles de respuesta de la PN en función del aumento de la concentración pueden pasar de un aumento monótono a un aumento-disminución y, en el caso extremo, desaparecer. Este resultado y el ajuste de concentración inusual observado de la respuesta de geosmina sugieren que, en contraste con otros insectos, las respuestas de geosmina en las abejas son de hecho más amplias en comparación con otros olores.

La literatura sugiere que las interacciones del olor ocurren en diferentes niveles del sistema olfativo. A nivel del receptor, los odorantes pueden provocar respuestas inhibidoras. Mezclado con un componente excitatorio, se ha observado una supresión de este último37. Esto altera no solo la amplitud de la respuesta ORN sino también la dinámica de la respuesta, lo que probablemente afecta no solo la percepción de la intensidad del olor sino también la percepción de la identidad del olor44. Estos efectos son específicos de los receptores individuales y se mostrarían en una señal de EAG como una pequeña reducción de la respuesta neuronal sumada a una mezcla en comparación con la suma de las respuestas a los componentes individuales, como se observó en nuestros experimentos.

A nivel de las neuronas de proyección, comúnmente se observa el efecto de supresión de la mezcla, es decir, la respuesta glomerular a una mezcla es menor que a su componente más fuerte45. En las abejas melíferas, se encontró que las dos vías AL distintas respondían de manera diferente a las mezclas de olores. Mientras que las neuronas de proyección del tracto medial (m-PN) estaban dominadas por el compuesto más efectivo, las neuronas de proyección del tracto lateral (l-PN), de las que se tomaron imágenes en nuestros experimentos, a menudo mostraron respuestas suprimidas a las mezclas46. El papel de la interneurona inhibidora local en esta interacción se demostró en Drosophila mediante la administración de picrotoxina, un antagonista de los receptores tipo GABAA, que eliminó la supresión de la mezcla a nivel de PN47. El modelado computacional confirmó que el ensombrecimiento y el bloqueo de una respuesta de olor por otra probablemente se deba a la inhibición lateral en la abeja melífera AL48. Las simulaciones también sugieren que las mezclas permiten una codificación olfativa más rápida y fiable, lo que podría ser una de las razones por las que los animales suelen utilizar mezclas en la señalización química24.

En polillas, también se observaron efectos complementarios. Una mezcla bioactiva activó fuertemente un glomérulo adicional, insensible a los componentes individuales49. Si este efecto sinérgico se produce a nivel de los receptores o de la red AL sigue siendo una pregunta abierta.

Otros estudios han demostrado que el procesamiento de la información relacionada con la mezcla en el AL no es uniforme en todos los glomérulos, lo que podría ofrecer una posible explicación de la falta de evidencia en nuestros datos de PN y sugerir que una integración final de la información sobre la mezcla puede ocurrir en centros cerebrales de orden superior50.

El papel de la valencia del olor en las interacciones de la mezcla se estudió en Drosophila. Las mezclas de olores con valencias opuestas provocaron una fuerte inhibición en los glomérulos sensibles a la atracción. La manipulación de ORN individuales mediante el silenciamiento y la activación optogenética reveló una diafonía específica del glomérulo entre los circuitos de respuesta atrayente y repelente. Se descubrió que esta inhibición lateral selectiva es crucial en el procesamiento de información sensorial contradictoria51.

En conjunto, estos trabajos pintan una imagen similar a la que estamos obteniendo de nuestros datos, a saber, que la interacción dentro de las mezclas de olores no tiene un punto de interacción específico, sino que es un efecto que se genera, amplifica y descifra a lo largo de diferentes etapas de procesamiento. en el sistema olfativo del insecto.

Los experimentos de comportamiento mostraron que el comportamiento punzante provocado por IAA se reduce fuertemente por Geosmin, pero solo a una concentración baja de 10–6, a una concentración mayor de 10–3 el efecto desaparece por completo. Una prueba de la interacción entre ambos olores a nivel de las antenas muestra un resultado compatible: vemos una reducción significativa de la señal de respuesta global al IAA + Geo 10–5 con respecto al IAA puro, al aumentar las concentraciones de geosmina el efecto se desvanece . El hecho de que el efecto de comportamiento y las respuestas de PN ya se detecten en concentraciones de geosmina de 10–6, para las cuales las antenas no mostraron un EAG medible, muestra lo difícil que es comparar concentraciones entre experimentos52. Las concentraciones solo se pueden medir en términos de diluciones de la fuente de olor, ya que las cantidades de geosmina que llegan a las antenas están muy por debajo del límite de detección de cualquier dispositivo. Debido a que la distribución de olores en las configuraciones experimentales para imágenes in vivo y mediciones de EAG son muy diferentes, los escenarios comparables no están indicados por la misma dilución sino por tamaños de efecto similares. Si bien una concentración de 10 a 6 geosmin no provoca una señal de EAG por encima del umbral, provoca respuestas claras en las imágenes y el comportamiento del calcio, lo que sugiere una concentración "efectiva" más baja en EAG.

Los experimentos de imágenes de calcio arrojaron luz sobre las respuestas de olor de geosmina, IAA y las mezclas al nivel de las neuronas de salida del lóbulo antenal. El resultado más sorprendente aquí es que también la geosmina por sí misma muestra una respuesta reducida en los glomérulos fotografiados cuando aumenta la concentración, lo que respalda la observación de respuestas conductuales reducidas pero parece contradecir los resultados de EAG, donde las respuestas ORN aumentaron con la concentración por encima del rango observado. de concentraciones Sin embargo, el modelo de computadora ofrece una explicación, a saber, que a pesar de un aumento monótono en las respuestas de ORN a la geosmina, la inhibición lateral en el AL podría causar que la señal de PN se reduzca fuertemente según se observa en las imágenes de calcio.

Sin embargo, queda una inconsistencia: a nivel del lóbulo antenal, no se pudo observar ninguna interacción entre geosmina e IAA, la señal de mezcla es casi exactamente la suma de las señales de ambos componentes. Tanto el EAG como el experimento conductual sugieren la presencia de tal interacción. Sin embargo, nuestros mapas de actividad de PN tampoco descartan la existencia de dicha interacción a nivel del lóbulo antenal, ya que nuestra técnica de imagen nos permitió registrar 19 glomérulos claramente identificables de los aproximadamente 160 presentes en el lóbulo antenal de una abeja melífera. De estos 19 glomérulos, solo 2 respondieron fuertemente a IAA. Por lo tanto, no es improbable que pueda estar presente una interacción en los glomérulos que no son accesibles a la imagen óptica. Sin embargo, dado que no hay evidencia directa de una interacción, queda otro nivel en el que la interacción podría tener lugar, a saber, en los centros cerebrales de nivel superior. Hasta la fecha, la obtención de imágenes de patrones de respuesta en el cuerpo del hongo de la abeja melífera53 y el cuerno lateral54 ha demostrado ser extremadamente desafiante y la codificación de mezclas de olores nunca se ha estudiado allí. Pero el desarrollo reciente de una línea transgénica de abejas melíferas, que expresa un sensor de calcio panneuronal, genera esperanzas de que en el futuro incluso sea posible obtener imágenes paralelas de todo el sistema olfativo y permitir el seguimiento de las interacciones de la mezcla a lo largo de todos los pasos del procesamiento. Los estudios de imágenes en Drosophila sugieren que la modulación de un comportamiento desencadenado por la feromona de alarma bien puede ocurrir allí, ya que se ha observado la codificación de la valencia del olor55,56 y la segregación de feromonas de los olores de los alimentos57 en estas partes del cerebro.

Otro resultado del experimento de imágenes de calcio fue que, a diferencia de las moscas y los mosquitos, en las abejas la geosmina no está codificada por una línea etiquetada, pero su espectro de respuesta parece, por el contrario, incluso mayor que el de los compuestos florales y feromonales probados. El modelo computacional mostró que la dependencia de la concentración no monótona de la respuesta de geosmina y su amplio espectro de respuesta podrían estar vinculados a la amplitud de la respuesta no monótona debido a la inhibición lateral. De hecho, el modelo también proporciona una configuración de ejemplo en la que la señal IAA en la antena se reduce a medida que se agrega geosmina, debido a las interacciones sintópicas de los olores en los receptores. Esto no reproduce completamente los resultados detallados del comportamiento y EAG, en los que se observó la supresión más fuerte a bajas concentraciones de geosmina. La respuesta total del reservorio del receptor a las mezclas de IAA y geosmina depende de los detalles de las afinidades de todos los tipos de receptores tanto para los olores como para su dependencia de la concentración, incluidas las interacciones sintópicas, pero también el reclutamiento de más receptores y más tipos de receptores a medida que aumenta la concentración. lo que bien puede explicar las diferencias observadas.

Estos resultados constituyen otro paso hacia la comprensión de la modulación olfativa del comportamiento defensivo en las abejas melíferas, tanto a nivel conductual como neuronal. Además de una comprensión fundamental de los circuitos neuronales que conducen a la picadura, esto también puede ser de utilidad práctica para la apicultura.

Estudios recientes propusieron el uso de geosmina como repelente natural contra insectos plaga como D. suzukii58. Antes de cualquier comercialización de geosmina para este propósito, se debe realizar una mayor investigación sobre las consecuencias de la geosmina en insectos no objetivo, como las abejas melíferas.

El contexto es clave para las respuestas de feromonas, por lo tanto, se requerirán experimentos en el campo para comprender completamente el efecto de la geosmina. Esto debe incluir el seguimiento del comportamiento, especialmente en la entrada de la colmena, el control de la edad de las abejas, su papel en la colonia y si salen volando o regresan.

Seguir la actividad neuronal provocada en los centros de procesamiento olfativo de orden superior, como el cuerno lateral y los cuerpos de hongos, también sería una dirección futura valiosa para estudiar la valencia de geosmina, IAA y sus mezclas en diferentes concentraciones. Esto podría complementarse con modelos adicionales para respaldar mejor nuestra comprensión de los circuitos y procesos subyacentes y generar hipótesis comprobables para desafiar esa comprensión.

En conjunto, nuestros datos y modelo proporcionan la primera evidencia de que la geosmina modula fuertemente el comportamiento defensivo de las abejas melíferas en función de propiedades de respuesta neuronal inusuales; por lo tanto, es probable que tenga una relevancia ecológica para las abejas. La naturaleza de esta relevancia sigue siendo puramente especulativa. Para los humanos, la geosmina sirve como indicador meteorológico. El mecanismo por el cual el olor de la geosmina a menudo precede a la lluvia se ha revelado recientemente13: cuando las gotas de lluvia tocan el suelo, producen aerosoles que transportan polvo, olores e incluso las propias bacterias productoras de geosmina, a veces a lo largo de muchos kilómetros. La cuestión de si también las abejas explotan esta información debería ser objeto de seguimiento. Comprender el papel de la geosmina y su posible participación en la señalización de lluvias inminentes también podría ayudar a anticipar problemas en la adaptación de las abejas al cambio climático y así prevenir daños ecológicos y económicos.

Se recolectaron abejas recolectoras de miel de varias colonias de Apis mellifera ligustica, ubicadas en Rovereto, Italia, de septiembre de 2019 a noviembre de 2019 y de julio de 2020 a agosto de 2020. Las colonias buscaban alimento libremente y se sometieron a inspecciones apícolas de rutina durante todo el período de los experimentos. Se incluyó un número igual de abejas de diferentes colonias en los experimentos de comportamiento. Las abejas fueron atrapadas en días soleados y nublados (pero no en días lluviosos) en dos rondas (alrededor de las 10:30 a. m. o las 14:00 p. m.).

Los recolectores se recogieron utilizando un recipiente de plástico cuando salían de las colmenas, se llevaron de vuelta al laboratorio y se colocaron en una nevera. Cuando las abejas estaban inmóviles, se colocaron en pares en tubos de centrífuga de 50 ml modificados en jeringas. Se colocaron dos gotitas de solución de sacarosa (50% de sacarosa en agua, vol/vol) en el tubo después de que las abejas se recuperaron por completo. Se permitió que todas las abejas se recuperaran durante al menos 15 min (hasta ~ 1 h para las últimas abejas) antes de ser probadas en el montaje que investiga el comportamiento de picadura. Si una o ambas abejas mostraban signos de recuperación deficiente cuando se colocaban en la configuración (dificultad para mantenerse boca abajo, desorientación y/o caminar letárgico), se excluía todo el ensayo de un análisis posterior. Todos los materiales utilizados para contener las abejas fueron lavados y limpiados con etanol al 80%, antes del siguiente uso.

En total, 288 abejas participaron en los experimentos de comportamiento, distribuidas equitativamente entre las 6 condiciones de olor (por lo tanto, un tamaño de muestra de 48 abejas por grupo). Este tamaño de muestra fue elegido en base a estudios previos19,59.

Todos los olores se obtuvieron de Sigma-Aldrich (98–99,9 % de pureza) y se almacenaron a 4 °C. Se diluyeron en aceite mineral al comienzo del período experimental y se mantuvieron durante todo el experimento de comportamiento. Cuando no estaban en uso, estos olores se sellaron y almacenaron a temperatura ambiente. El principal componente de la feromona de alarma de picaduras, el acetato de isoamilo (IAA), se diluyó a 10–1 (vol/vol) como en estudios previos19,59. Se eligieron las concentraciones de 10–3 y 10–6 para la geosmina, ya que se demostró que provocan respuestas conductuales en moscas de la fruta8 y mosquitos10.

Los olores se entregaron a temperatura ambiente (24 °C) colocando un papel de filtro empapado con 10 μl de solución de olor en un flujo de aire que se inyectó horizontalmente a través de 3 canales igualmente espaciados en la arena de prueba (Fig. 1a). Los olores se eliminaron de la arena a través de 40 orificios igualmente espaciados en la tapa superior. El flujo permaneció encendido durante toda la duración de la prueba (3 min). Para probar las interacciones entre 2 olores, se colocaron en el flujo de aire 2 papeles de filtro, cada uno con uno de los olores. El flujo de olor entrante se controla a través de un detector de fotoionización (200B miniPID, aurora Scientific). Sin embargo, esto permite resolver solo las concentraciones de olor más altas y sirve para asegurar la reproducibilidad de las condiciones entre sesiones experimentales. En la arena, el movimiento turbulento del aire en el interior provoca inevitablemente fluctuaciones de concentración en el espacio y el tiempo.

La capacidad de respuesta a la picadura de las abejas se probó utilizando el ensayo descrito en detalle en 19. Brevemente, se introdujeron díadas de abejas melíferas en una arena de prueba cilíndrica en la que se enfrentaron a un maniquí giratorio negro, prolongado por una pluma negra (Fig. 1a, Película complementaria 1). La función principal de la pluma negra es molestar a las abejas sin causarles ningún dolor, rozando los lados de la arena. Tenga en cuenta que las abejas pueden evitar fácilmente tanto el maniquí como la pluma. Una prueba duró 3 minutos y se calificó como "picadura" si al menos una de las abejas decidía picar al maniquí durante este tiempo. Este comportamiento se definió como la abeja sujetando el maniquí o la pluma durante al menos 3 s, con la punta del abdomen presionada contra ella en la característica postura de picadura. Todas las pruebas de comportamiento se grabaron con una cámara web (Microsoft Life cam) colocada sobre la arena.

Se utilizaron dos arenas idénticas y 2 maniquíes. Su uso se equilibró en las diferentes condiciones de olor, para garantizar que no contribuyeran a posibles diferencias en el comportamiento. Antes de cada prueba, la arena y los maniquíes con sus plumas se limpiaron con una solución de etanol al 80%.

Se utilizó un modelo lineal generalizado (glm) para analizar el porcentaje de ensayos de picadura. El grupo olor se fijó como factor fijo mientras que la colmena y el maniquí se definieron como factores aleatorios. Se realizó una comparación por pares (paquete glht en R) seguida de la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini y Hochberg para controlar los errores de tipo I.

La técnica EAG se adaptó de 60 y los registros se realizaron utilizando un aparato EAG estándar (Syntech, Hilversum). Las abejas melíferas se recolectaron y manipularon de la misma manera que para el ensayo de comportamiento. Después de enfriarlos en hielo, se cortó una antena de cada animal al nivel del escapo. Para este experimento se utilizó un total de n = 24 antenas de los lados izquierdo y derecho (14 antenas izquierdas y 10 derechas) para evitar efectos de lateralización20. Luego, la base de cada antena se insertó en el electrodo de referencia de vidrio lleno de solución salina de Kaissling61 que constaba de lo siguiente: NaCl (7,5 g/l); CaCl2 (0,21 g/l); KCl (0,35 g/l); NaHCO3 (0,2 g/l). El electrodo de registro se puso en contacto con el último segmento del flagelo del que se había cortado la punta distal. La caída de voltaje registrada provocada por un estímulo de olor suma las despolarizaciones en todas las neuronas receptoras olfativas activadas y depende del número de neuronas activadas así como de sus amplitudes de actividad.

Se usó un olfatómetro hecho a la medida para enviar olores a las antenas de las abejas. Los estímulos de olor se originan a partir de viales de vidrio que contienen 1 mL de olores disueltos en aceite mineral. El olfatómetro se hizo funcionar con LabView y los canales individuales se conmutaron mediante válvulas solenoides (LHDA0531115, The Lee Company) controladas por una placa multifunción PCIe-6321 (National Instruments). El flujo de aire durante la grabación se mantiene constante durante todas las fases del experimento (Para más detalles ver 62).

Siete soluciones de aceite mineral de Geosmin (Geo) en concentraciones 10–6, 10–5, 10–4, 10–3 vol/vol, Acetato de isoamilo (IAA) en concentraciones 10–3, 10–1 vol/vol, o Se preparó aceite mineral puro (control). Se llenaron viales de vidrio del olfatómetro con estas soluciones. El protocolo de estimulación para cada abeja consistió en presentar cada olor y una combinación de olores en orden ascendente de concentraciones, dando lugar a 15 estímulos, ver Fig. 2b–d: Control, Geo 10–6, Geo 10–5, Geo 10– 4, Geo 10–3, IAA 10–3, IAA 10–3 + Geo 10–6, IAA 10–3 + Geo 10–5, IAA 10–3 + Geo 10–4, IAA 10–3 + Geo 10– 3, IAA 10–1, IAA 10–1 + Geo 10–6, IAA 10–1 + Geo 10–5, IAA 10–1 + Geo 10–4, IAA 10–1 + Geo 10–3. La duración del estímulo fue de 2 s y el intervalo interestímulo fue de 20 s. Además, cada ciclo se repitió 10 veces y por lo tanto se presentaron un total de 150 estímulos a cada antena de abeja, esto resultó en grabaciones de 55 min de duración total. El flujo de olor que llega a las antenas se controla a través de un detector de fotoionización (200B miniPID, aurora Scientific). Sin embargo, esto solo permite resolver concentraciones de olor > 10–5 y sirve para asegurar la reproducibilidad entre sesiones experimentales únicas y entre EAG e imágenes de calcio, porque solo para estos experimentos podemos garantizar un flujo uniforme a través del área experimental.

La amplitud de la respuesta se calculó restando el voltaje promediado durante 1 s antes de cada estímulo del voltaje promediado durante 1 s después del inicio del estímulo. Posteriormente, estos valores se promediaron durante las diez repeticiones de cada estímulo. Las respuestas se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas seguido de pruebas post hoc de Bonferroni.

Se realizaron normalizaciones para cada concentración de IAA (0, 10–3 y 10–1), dividiendo las respuestas obtenidas para cada concentración de geosmina combinada respectivamente con cada concentración por la respuesta al estímulo sin geosmina. En el caso del control (MO), se sumó 1 a todos los valores antes de la normalización, impidiendo valores entre 0 y 1 en el factor de normalización. Después de la normalización, se realizaron pruebas no paramétricas (prueba de Friedman seguida de comparaciones múltiples de Dunn) para las comparaciones estadísticas.

Las abejas melíferas se prepararon para el experimento de obtención de imágenes de calcio in vivo de acuerdo con un protocolo bien establecido62. Las forrajeras utilizadas se recogieron e inmovilizaron en un frigorífico a 4 °C durante 5-6 min. Luego, las abejas inmovilizadas se fijaron en una platina de formación de imágenes hecha a medida, utilizando cera dental suave (Deiberit 502, Siladent). Se cortó una pequeña ventana rectangular en la cutícula de la cabeza de la abeja fija. Las glándulas y la tráquea se apartaron y se inyectó fura2-dextrano, un colorante fluorescente sensible al calcio (Thermo-Fischer Scientific) disuelto en agua destilada, en los tractos anteno-cerebrales justo debajo del lóbulo α utilizando una micropunta63. Después de la inyección, la cutícula se fijó en su estado original utilizando n-eicosano. Las abejas se almacenaron en un lugar oscuro, fresco y húmedo durante aproximadamente 20 h para garantizar que el tinte de calcio se haya difundido en el AL.

Justo antes de la sesión de imágenes, se extrajeron por completo la ventana cuticular, la tráquea y las glándulas. Se utilizó un adhesivo de silicona (Kwik-Sil) para cubrir la ventana abierta en la parte superior de la cabeza de la abeja y se dejó secar durante unos minutos. Luego, la señal fluorescente en el lóbulo antenal se tomó bajo un microscopio de dos fotones.

El microscopio de dos fotones (Ultima IV, Bruker) se basa en un láser de pulso ultracorto (Mai Tai, Deep See HP, Spectra-Physics). El láser se ajustó a 780 nm para la excitación de fura2. Todas las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de inmersión en agua (10 \(\times\), NA 0.3, Olympus). La fluorescencia se recogió en configuración epi, se seleccionó mediante un espejo dicroico y se filtró con un filtro de paso de banda centrado en 525 nm y con un ancho de banda de 70 nm (Chroma Technology Corp). Finalmente, fue detectado por un tubo fotomultiplicador (Hamamatsu Photonics). Se utilizaron potencias de láser de aproximadamente 10 mW para equilibrar la relación señal-ruido (SNR) frente a los efectos del fotodaño que reducían la vida útil de las abejas.

El campo de visión de 280 × 280 µm2 se resolvió en 128 × 128 píxeles. La intensidad de fluorescencia se registró con una profundidad de 13 bits. La adquisición de imágenes a una velocidad de fotogramas de 10,1 Hz se sincronizó con el protocolo de estímulo.

Además de las imágenes funcionales, se adquirió un z-stack del lóbulo antenal con una resolución espacial de 512 × 512 píxeles y una distancia de capa z de 2 µm para realizar la identificación morfológica de los glomérulos.

El olfatómetro utilizado para emitir olores bajo el microscopio de dos fotones fue el mismo que se utilizó en el experimento EAG. Durante una sesión de imágenes, los olores de interés (Geosmin 10–6, Geosmin 10–3 y 10–1 IAA) se presentaron a la abeja en una secuencia, ya sea como un solo olor o como mezclas, y la secuencia se repitió 10 veces. . Cada pulso de estímulo duró 3 s con un intervalo entre estímulos de 12 s y un sistema de escape elimina rápidamente los olores del área experimental. Para comparar la fuerza y ​​amplitud de la respuesta, también se probaron 3 olores florales con las mismas secuencias (1-nonanol 5·10–3, acetofenona 5·10–3 y 3-hexanol 5·10–3).

Se registraron y analizaron las señales de un total de 14 abejas. El análisis de datos fue completamente automatizado, basado en scripts personalizados de MATLAB (R2019b, MathWorks). Las series temporales de fluorescencia, que contenían una secuencia experimental completa, se separaron en períodos de 3 s antes del estímulo, 3 s durante el estímulo y 3 s después del estímulo para cada ensayo. Para cada cuadro, calculamos el cambio relativo de fluorescencia

a través de la normalización de la señal de fluorescencia sin procesar \(F\left(t\right)\) por la señal promedio durante el período previo al estímulo Fb. Esta señal es proporcional al cambio relativo en la concentración de calcio y, por lo tanto, a la tasa de activación neuronal64. Se promedió ΔF/F durante los 10 ensayos para cada olor. A continuación, los mapas de actividad 2D se segmentaron para respuestas glomerulares individuales. Los límites glomerulares se obtuvieron mediante la comparación recursiva de tres fuentes de información, las características anatómicas de una pila de imágenes 3D grabada adicionalmente (Figura complementaria 2a), los mapas de respuesta funcional (Película complementaria 2) y un análisis de homogeneidad regional que prueba la correlación entre la señales de cada píxel y las de los píxeles vecinos. Esta medida es alta dentro de los glomérulos individuales y cae en sus bordes (Fig. 2b complementaria). Después de segmentar las estructuras que respondían coherentemente, se determinó la identidad glomerular utilizando el atlas 23 del lóbulo antenal 3D digital. El análisis se limitó a los 19 glomérulos identificados con mayor frecuencia. Si la identidad de los glomérulos individuales no se pudo determinar con certeza, se descartaron, de modo que el número total de glomérulos analizados fluctuó entre las abejas (Fig. 4c).

Se realizó un análisis estadístico de las respuestas medias de los sujetos a olores únicos mediante pruebas t pareadas con corrección FDR.

Las neuronas en el modelo se describen mediante una neurona adaptativa de integración y disparo con fugas con una ecuación de potencial de membrana

donde \(\sigma \sim \mathcal{N}\left(\mathrm{0,1}\right)\) es ruido blanco normalmente distribuido y el factor \(k\) se usa para reescalar las corrientes de entrada en los ORN. Para las neuronas receptoras olfatorias (ORN), la corriente de entrada es la corriente que pasa a través de los receptores olfativos (OR) y \(k=10\), mientras que para las neuronas locales (LN) y de proyección (PN), son las corrientes sinápticas de las sinapsis entrantes. con \(k=1\). Todas las neuronas tienen \(C=1\) nF, \({V}_{\text{fuga}}=-60\) mV, \({g}_{\text{fuga}}=10\) nS , y \(A=1.4\) nA. Cada vez que el potencial de membrana \(V\) cruza el umbral de disparo \({V}_{th}=-40\) mV, se emite un pico y el potencial de membrana se restablece a \({V}_{\text{ restablecer}}=-70\) mV. Las PN no tienen una corriente de adaptación, pero las ORN y las LN tienen una adaptación de velocidad máxima con \({g}_{\text{adapt}}=1.5\) nS para las ORN, y \({g}_{\text{adapt }}=0.5\) nS para LN. La variable de adaptación estuvo regida por

donde \(\delta\) es la distribución delta de Dirac y \({\tau }_{\text{adapt}}=1\) s para ORN y LN.

Las sinapsis se describen con un aumento instantáneo de la activación sináptica \(s\) tras la llegada de un pico y el posterior decaimiento exponencial,

y una corriente de entrada basada en la conductancia en la neurona postsináptica,

con potencial de inversión \({V}_{\text{rev}}=0\) mV para excitatorio (ORN a PN, ORN a LN, PN a LN) y \({V}_{\text{rev}} =-80\) mV para sinapsis inhibitorias (LN a PN y LN a LN).

Los receptores olfativos y el proceso de transducción se describen mediante un modelo estándar de tasa de activación y unión de dos etapas (ver, por ejemplo, 65, 66, 67, 68),

donde \({r}_{0}\) es la fracción de receptores no unidos, \({r}_{i}\) las fracciones de receptores unidos a olores \(i=1, \dots , N\), y \({r}_{i}^{*}\) son las fracciones de receptores unidos y activados por los olores \(i\). Las constantes \({k}_{1}^{i}\) y \({k}_{2}^{i}\) describen respectivamente la tasa de unión y activación por el olor \(i\ ), mientras que \({k}_{-1}^{i}\) y \({k}_{-2}^{i}\) describen la desvinculación y la inactivación. Todas las constantes \(k\) pueden ser específicas de los olores y tipos de receptores. En este trabajo, elegimos constantes individuales \({k}_{1}^{i}\) para cada par de tipos de receptores de olores y olores específicos (pero iguales para todos los tipos de receptores) \({k}_{2 }^{yo}\). \({k}_{-1}^{i}={k}_{-2}^{i}=0.025\) kHz fueron idénticos para todos los olores y tipos de receptores.

Las constantes de unión individuales para cada odorante a través de los receptores se eligieron como perfiles gaussianos,

donde \(\pi \left(\cdot \right)\) es una permutación (elegida al azar) de \(1,\dots ,{N}_{\text{glo}}\), y \(\eta\ ) es una variable aleatoria distribuida \({\mathcal{N}}_{1.5,{0.5}^{2}}\), truncada a valores dentro de \(\left[0, 4\right]\). La desviación estándar \(\sigma\) de los perfiles de olor se tomó como muestra de \({\mathcal{N}}_{3,{0.5}^{2}}\), truncada a valores mayores o iguales a 1.5, todo en unidades de kHz.

La constante de activación \({k}_{2}^{i}\) para cada olor se tomó como muestra de \({\mathcal{N}}_{0.02,{ 0.02}^{2}}\), truncada a valores dentro de \(\left[0.0028, 0.2\right]\), en unidades de kHz.

Para las simulaciones de este trabajo, generamos 98 olores de acuerdo con estas reglas y dos olores adicionales, que identificamos con IAA y Geosmin. Para "IAA" asumimos una sensibilidad comparativamente baja de \({\eta }^{\text{IAA}}=0.8\), y un perfil de respuesta estrecho con \({\sigma }^{\text{IAA}} =3\). La tasa de activación fue \({k}_{2}^{\text{IAA}}=0.1\) muy alta. Para "Geosmin" asumimos una alta sensibilidad \({\eta }^{\text{geo}}=4.4\), y un amplio perfil de respuesta con \({\sigma }^{\text{geo}}=10\ ), mientras que la tasa de activación fue moderada, \({k}_{2}^{\text{geo}}=0.003\). Se desconocen los valores verdaderos de estos parámetros y los valores elegidos aquí finalmente se eligieron para que las respuestas "IAA" y "Geosmin" exhibieran las propiedades (fuerte respuesta de crecimiento monótono y respuesta que se desvanece con el aumento de la concentración) que intentamos demostrar como factible dentro de este tipo de modelo. Generamos los olores "IAA" y "geosmina" con una distancia fija de 30 tipos OR de pico a pico antes de codificar ambos con la misma permutación. Esto asegura que los dos olores tengan una cantidad específica de superposición con implicaciones en particular para las interacciones en el OR de la antena, como se evidencia a través de los recuentos de picos de ORN.

La red modelo se ilustra en la Fig. 4a. Simulamos 160 tipos de receptores69. Witthöft70 reportó 5776 sensilla placoide en la antena de una abeja obrera, con 12–20 ORN en cada sensillum, por lo que en el rango de 69,312 y 115,520 ORN en total). Hemos modelado 10 ORN en una sola neurona modelo con tasas de activación 10 veces más altas para lograr una eficiencia numérica, es decir, 60 neuronas modelo ORN por tipo, 9600 en total. Esta es una práctica común en el modelado de sistemas olfativos, que es exactamente donde los ORN se modelan como procesos de Poisson, y una buena aproximación para otros tipos de modelos de neuronas. Tenga en cuenta que se supone que todos los ORN no interactúan, lo que permite esta simplificación. El AL tiene un estimado de 800 PN71,72, lo que equivale a 5 PN simuladas por glomérulo y 4000 LN70, es decir, 25 LN simuladas por glomérulo. Ver también23 para un modelo publicado muy similar. Cada uno de los 5 PN y 25 LN en un glomérulo está conectado a 12 ORN elegidos al azar de su tipo de receptor. Los PN excitan todos los LN en sus glomérulos y los LN inhiben todos los PN y LN en todos los glomérulos excepto los suyos, implementando un motivo de red comúnmente asumido de inhibición lateral de todos a todos. Los parámetros de sinapsis para estas conexiones se resumen en la Tabla 1. Todas las ecuaciones diferenciales se integraron con un algoritmo de Euler lineal y un paso de tiempo global de 0,2 ms.

Los modelos se implementaron utilizando la interfaz PyGeNN73 para GeNN 4.5.074,75. GeNN está disponible en https://github.com/genn-team/genn y el código fuente para el trabajo de modelado en este documento está disponible en https://github.com/tnowotny/bee_al_2021, incluidos los cuadernos Jupyter para análisis y trazado. . Las simulaciones se ejecutaron en una estación de trabajo Linux, con Ubuntu 18.04.5 LTS.

La monotonicidad de la respuesta x (x = función de densidad de punta máxima (SDF) o SDF promediada, cada uno en todos los glomérulos) en este contexto se calculó como.

es decir, la diferencia entre el SDF en la concentración de olor más alta probada (\({10}^{-1})\) y el SDF más alto observado, normalizado por el SDF medio observado, donde el máximo y el medio se tomaron en todas las concentraciones de \({10}^{-7}\) a \({10}^{-1}\). La monotonicidad toma valores menores o iguales a 0, y los olores monotónicos tienen \(m=0\).

Calculamos las funciones de densidad de picos (SDF) como una estimación suave de la tasa de disparo76. El SDF se calculó mediante la convolución del tren de picos (entendido como un proceso puntual) con una función kernel gaussiana,

con \(\sigma =100\) ms.

Los conjuntos de datos adquiridos y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente ([email protected]) previa solicitud razonable, el código fuente para el modelado está disponible en https://github.com/tnowotny/bee_al_2021.

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FS fue apoyado por MIUR [PRIN 2017MKNP2F]. ET fue apoyado por la Universidad de Trento [proyecto estratégico BRANDY]. AC fue financiado por la Provincia Autónoma de Bolzano [Proyecto B26J16000310003]. MN fue apoyado por fondos de la Zukunftskolleg (Universidad de Konstanz) y el programa de movilidad Erasmus + Staff. TN recibió el apoyo de EPSRC [P/P006094/1, EP/S030964/1], una subvención para proyectos de investigación de Leverhulme Trust y el programa de investigación e innovación Horizon 2020 de la Unión Europea [acuerdo de subvención n.º 945539 (HBP)].

Amélie Cabirol

Dirección actual: Departamento de Microbiología Fundamental, Universidad de Lausana, CH-1015, Lausana, Suiza

Departamento de Física, Universidad de Trento, 38120, Trento, Italia

Florencia Scarano y Albrecht Haase

Centro de Ciencias de la Mente/Cerebro (CIMeC), Universidad de Trento, 38068, Rovereto, Italia

Florencia Scarano, Mukilan Deivarajan Suresh, Ettore Tiraboschi, Amélie Cabirol & Albrecht Haase

Departamento de Biología, Universidad de Konstanz, 78457, Konstanz, Alemania

morgane nouvian

Future College, Universidad de Constanza, 78464, Constanza, Alemania

morgane nouvian

Escuela de Ingeniería e Informática, Universidad de Sussex, Brighton, BN1 9QJ, Reino Unido

Tomas Nowotny

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FS realizó y analizó el registro de EAG, MS, AC y MN realizaron y analizaron los experimentos de comportamiento, ET realizó y analizó los experimentos de imágenes de calcio, TN desarrolló, realizó y analizó el modelado computacional, AH proporcionó financiación e instrumentación y supervisó el estudiar. Todos los autores contribuyeron a la preparación y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Thomas Nowotny o Albrecht Haase.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Scarano, F., Deivarajan Suresh, M., Tiraboschi, E. et al. Geosmin suprime el comportamiento defensivo y provoca respuestas neuronales inusuales en las abejas melíferas. Informe científico 13, 3851 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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Recibido: 24 de octubre de 2022

Aceptado: 01 de marzo de 2023

Publicado: 08 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30796-5

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