Un regulador de presión impreso en 3D (µPR) miniaturizado para aplicaciones de cultivo celular microfluídico | Beijing AgileLift Ventures Group Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 10769 (2022) Citar este artículo

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Los flujos de fluidos bien definidos son la característica distintiva de los sistemas de cultivo de microfluidos y permiten un control preciso sobre las señales biofísicas y bioquímicas a escala celular. El control del flujo de microfluidos generalmente se logra utilizando técnicas basadas en desplazamiento (p. ej., jeringa o bombas peristálticas) o controladas por presión que brindan numerosas opciones de perfusión, incluidos flujos constantes, en rampa y pulsados. Sin embargo, puede ser un desafío integrar estos dispositivos de factor de forma grande y los periféricos que los acompañan en incubadoras u otros entornos confinados. Además, los estudios de cultivo de microfluidos se llevan a cabo principalmente en condiciones de perfusión constante y, a menudo, no se utilizan capacidades de flujo más complejas. Por lo tanto, existe la necesidad de una plataforma de control de flujo simplificada que proporcione capacidades de perfusión estándar y que pueda integrarse fácilmente en entornos incubados. Con este fin, presentamos un microregulador de presión ajustable impreso en 3D (µPR) y demostramos que puede proporcionar capacidades sólidas de control de flujo cuando se combina con una bomba de aire en miniatura alimentada por batería para admitir aplicaciones de microfluidos. Detallamos el diseño y la fabricación del µPR y: (i) demostramos un rango de presión de salida ajustable relevante para aplicaciones microfluídicas (1–10 kPa), (ii) destacamos las capacidades de control dinámico en una red microfluídica, (iii) y mantenemos el umbilical humano células endoteliales de vena (HUVEC) en un dispositivo de cultivo multicompartimental en condiciones de perfusión continua. Anticipamos que nuestro enfoque de fabricación impresa en 3D y los diseños de acceso abierto permitirán µPR personalizados que pueden admitir una amplia gama de aplicaciones de microfluidos.

Los enfoques de microfluidos aprovechan la manipulación precisa de fluidos para introducir capacidades experimentales únicas en aplicaciones biológicas1,2,3, incluida la estimulación biofísica definida de células cultivadas4,5,6,7,8, la entrada controlada de compuestos químicos9,10,11 y la introducción de poblaciones celulares secundarias al medio de cultivo12,13. En estos sistemas, el control sobre el flujo de fluidos generalmente se logra a través de esquemas de bombeo neumáticos o basados en desplazamiento14,15,16. Por ejemplo, las bombas de jeringa utilizan el movimiento rotatorio de tornillos mecánicos para dispensar fluido desde un cilindro de jeringa a un caudal controlado (Q), mientras que las bombas peristálticas emplean un mecanismo de leva para empujar o extraer fluidos a través de un tubo flexible para controlar directamente Q17. Aunque las bombas peristálticas y de jeringa se utilizan con frecuencia debido a sus sólidas capacidades de control de flujo y compatibilidad con componentes estandarizados (p. ej., jeringas, accesorios y tubos), puede ser difícil integrarlos en entornos confinados18. Además, las oscilaciones mecánicas del mecanismo de tornillo o leva pueden introducir pulsaciones de flujo no deseadas que resultan en daño celular19,20,21,22.

Por el contrario, los esquemas de bombeo neumático crean una caída de presión definida (ΔP) a través de redes microfluídicas para controlar Q. Para estos flujos impulsados por presión, Q se define mediante la ecuación de Hagen-Poiseuille, Q = ΔPR−1, que se puede considerar como la analogía hidráulica con la Ley de Ohm, donde R es la resistencia fluídica definida por la geometría de la red y la viscosidad del fluido23. Debido a la naturaleza amortiguadora intrínseca de los sistemas neumáticos, estos enfoques son menos susceptibles a las pulsaciones de flujo en comparación con los métodos basados en desplazamiento18. Sin embargo, debido a los posibles cambios en la resistencia fluídica y los efectos de contrapresión concomitantes, los enfoques neumáticos a menudo requieren equipos periféricos complejos, como una fuente de aire de alta presión dedicada (p. ej., aire de laboratorio), un controlador de presión de circuito cerrado, reguladores de contrapresión y sensores de presión/flujo en línea para mantener el caudal deseado24,25,26. En consecuencia, los métodos neumáticos también pueden ser difíciles de integrar en entornos de cultivo celular confinados27.

Las técnicas de desplazamiento y neumáticas ofrecen excelentes capacidades de control de flujo y se pueden programar para ajustar dinámicamente los perfiles de flujo, incluidos flujos en rampa, periódicos, pulsados o incluso invertidos. Sin embargo, estas funciones avanzadas a menudo no se utilizan en aplicaciones microfluídicas estándar en las que se utiliza un caudal constante para perfundir o estimular células cultivadas28,29. La popularidad experimental de la tasa de perfusión constante y controlada nos permite priorizar una solución de bombeo simple y portátil sobre una con funcionalidades de flujo avanzadas e instrumentación compleja. También se han explorado ampliamente enfoques alternativos para simplificar el proceso de bombeo. Por ejemplo, se usó una bomba de infusión iPrecio recargable de mano comercial para mantener las células en cultivo30. Sin embargo, la bomba era cara, se usaba una sola vez y no se podía personalizar. Alternativamente, el bombeo pasivo, incluidos los métodos hidrostáticos y basados en la tensión superficial, son de bajo costo y fáciles de usar, pero carecen de estabilidad a largo plazo, lo que los hace inadecuados para aplicaciones de cultivo de microfluidos (> 24 h)31,32,33. También se han utilizado enfoques de sistemas microelectromecánicos (MEMS) para crear bombas microfabricadas34,35. Aunque estas microbombas pueden proporcionar el control a largo plazo necesario para las aplicaciones de laboratorio en chip, la complejidad de los procedimientos de fabricación puede hacer que la personalización y la implementación sean poco prácticas.

La impresión 3D, una tecnología de fabricación aditiva emergente, se ha adoptado como método de fabricación para dispositivos de control de flujo de microfluidos altamente personalizados debido a las capacidades de creación rápida de prototipos, los bajos costos de acceso en comparación con el fresado CNC multieje y los bajos costos de herramientas en comparación con el moldeo por inyección36,37 ,38,39. La impresión 3D simplifica los procesos de fabricación para características que son difíciles de crear (por ejemplo, muescas, características independientes y cavidades de alta relación de aspecto) utilizando tecnologías de mecanizado convencionales o procesos MEMS. Los investigadores han creado con éxito componentes impresos en 3D para reguladores de contrapresión40, microválvulas estilo Quake41 y dispositivos de conducción de flujo neumático26,42,43,44.

Para abordar la necesidad de una plataforma de bombeo simple pero funcional, presentamos una plataforma de bombeo neumático que utiliza un microregulador de presión (µPR) impreso en 3D para proporcionar un ∆P ajustable y controlar el caudal en una red de canales de microfluidos. Nuestro µPR utiliza un mecanismo de equilibrio de fuerza para reducir la presión suministrada por una bomba de aire alimentada por batería a un rango de presión controlable relevante para aplicaciones de microfluidos. En este trabajo, detallamos el diseño y la fabricación del µPR, establecemos el control dinámico de la presión y las características de estabilidad, y demostramos un cultivo exitoso dentro de un modelo de barrera microfluídica compartimentada basada en membrana45,46. Dado que las impresoras 3D se han vuelto ampliamente accesibles en los laboratorios de investigación y los espacios de creación de la comunidad47,48, anticipamos que nuestro µPR impreso en 3D, con diseños de acceso abierto, se puede fabricar y ensamblar en cualquier laboratorio y adaptarse para cumplir con los requisitos de flujo específicos de la aplicación.

Los componentes estructurales del µPR, incluidas las cámaras de entrada (alta presión) y salida (baja presión) y el componente de control de presión, se imprimieron en 3D con la impresora de estereolitografía Formlabs Form 2 (Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.) . Se seleccionó la resina Dental SG (Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.) como material de construcción debido a sus características de impermeabilidad a los gases y biocompatibilidad Clase I (EN-ISO 10993-1:2009/AC:2010). Las piezas impresas en 3D se retiraron de la plataforma de impresión, se enjuagaron con alcohol isopropílico al 99 %, se secaron con aire presurizado y se curaron con UV durante 45 min a 45 °C (FormCure, Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.), de acuerdo con con las recomendaciones del fabricante.

Se instaló una junta tórica de fluoroelastómero Viton (Shore 60A) de tamaño 001 (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) sobre la biela adyacente a la válvula de asiento de la cámara de entrada de alta presión, como se muestra en la Fig. 1a(i) . Luego se colocó una junta tórica de caucho natural (Shore 70A) de 8 mm de DI/10 mm de DE (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) en la ranura exterior de la cámara de entrada. La cámara de salida de baja presión, que se muestra en la Fig. 1a(ii), se colocó sobre la cámara de entrada con la biela que se extiende a través de la cavidad para formar el paso de aire de la cámara transversal. A continuación, se colocó un Kapton de 100 µm de espesor (Gizmo Dorks LLC, Temple City, CA, EE. UU.) en la cámara de salida como diafragma sensor de presión, en contacto con la biela. Como se muestra en la Fig. 1a(iii), se colocó una junta tórica en la parte superior del diafragma para ayudar a sellar la parte superior de la cámara de salida. El componente de control de presión con resortes en voladizo incorporados se apiló sobre el diafragma. Estos voladizos tenían 0,5 mm de ancho, 0,5 mm de espesor y 5 mm de largo. Se pegó una tuerca M2 (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) a los resortes en voladizo con adhesivo epoxi (ClearWeld™ Professional, JB Weld Company, Sulphur Springs, Texas, EE. UU.) (Fig. 1a(iv)). Como se muestra en la Fig. 1(v), se enroscó un perno M2 en la tuerca. Se agregó un puntero impreso en 3D a la cabeza hexagonal para crear la perilla de control. Se fijó un dial acrílico de 24 posiciones cortado con láser al componente de control de presión usando adhesivo sensible a la presión (PSA, 3M 468MP Adhesive Transfer Tape, 3M Company, Maplewood, MN, EE. UU.). El dial proporcionó indicaciones para las posiciones de rotación en incrementos de 15˚. Finalmente, se usaron abrazaderas impresas en 3D para comprimir las juntas tóricas exteriores intercaladas entre los componentes estructurales y completar el ensamblaje, como se muestra en la Fig. 1a (vi). El dispositivo ensamblado tiene 12 mm de diámetro y 20 mm de altura. La figura 1b muestra una imagen del dispositivo ensamblado junto a una moneda de diez centavos de EE. UU. para escalar. Vea el video complementario S1 que muestra el proceso de ensamblaje.

(a) Vista esquemática del flujo de trabajo de fabricación y µPR impreso en 3D. (i) La cámara de entrada de aire a alta presión incluye una válvula de asiento, una junta tórica de sellado (blanca) y una biela. (ii) La cámara de aire de baja presión se coloca encima de la cámara de entrada. (iii) Se coloca un diafragma Kapton (amarillo) y una junta tórica (negra) encima de la cámara de salida. (iv) El componente de control de presión, que consta de tres voladizos integrados y una tuerca roscada, se coloca encima de la junta tórica. (v) Un perno M2 con un indicador de posición impreso en 3D se enrosca en la tuerca. (vi) Luego, el dispositivo se sella con dos abrazaderas de compresión impresas en 3D para lograr un ensamblaje hermético (Φ12 mm × 20 mm) y se agrega un dial de posición cortado con láser. (b) Imagen del µPR impreso en 3D ensamblado junto a una moneda de diez centavos de los Estados Unidos para escalar.

Los microcanales de (poli)dimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184, Dow Inc., Midland, MI, EE. UU.) se fabricaron utilizando técnicas estándar de litografía blanda49,50. SU-8 2100 (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, EE. UU.) se revistió por rotación sobre una oblea de silicio de 4″, se horneó suavemente y se expuso a la luz ultravioleta a través de una máscara de transparencia (CAD/Arts Services Inc., Bandon, OR, USA) para definir las características del canal, y posthorneado a 95 °C. Luego se desarrolló la fotoprotección (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, EE. UU.). Un marco rectangular de PMMA con regiones abiertas con una longitud = 75 mm y una anchura = 25 mm se unió a la oblea usando PSA para crear una cavidad de moldeo con una altura definida. Después de unir el marco de PMMA, el molde se llenó con prepolímero de PDMS desgasificado (proporción de base a catalizador de 10:1 en masa) y se curó en una placa caliente durante 1 h a 80 °C. Luego, se retiró el bloque de PDMS del molde y se perforaron los puertos de acceso con un punzón de biopsia de 1 mm (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU.).

Se realizó una simulación 3D utilizando el módulo de física de flujo laminar (estacionario) en COMSOL Multiphysics. Se aplicó geometría de microcanales (20 µm de altura, 100 µm de ancho y 32 cm de longitud) con el material fraguado como agua. Asignamos presiones (P = 1–10 kPa) a la entrada de la geometría del microcanal, mientras que la presión de salida se definió como atmosférica (P = 0) con reflujo suprimido. A los otros lados del bloque se les asignaron condiciones de contorno de no deslizamiento.

La configuración experimental general incluía una resistencia de flujo de microfluidos µPR y PDMS (20 µm de altura, 100 µm de ancho y 32 cm de longitud). Suministramos presión al µPR con una bomba de aire de CC en miniatura SX-2 (Binaca Pumps, Temecula, CA, EE. UU.) que funciona a 3 V y 0,09 A. La salida del µPR se conectó a un conector de tres vías, con un extremo alimentando la entrada del canal de microfluidos PDMS y el otro conectado a un sensor de presión Honeywell (TBPDANS005PGUCV, Honeywell International Inc., Charlotte, NC, EE. UU.). Se utilizó un tubo de silicona (DI de 2 mm, longitud de 5 cm) para conectar estos componentes. El microcanal PDMS se cebó con una solución de colorante azul (McCormick Inc., Baltimore, MD, EE. UU.) en agua desionizada para mejorar el contraste.

La configuración experimental antes mencionada permitió la caracterización de Pout en función de la posición angular de la perilla de control. La perilla de control se giró en incrementos de 15º (indicados con el dial de acrílico) mientras se monitoreaba la faneca. Luego se permitió que Pout se estabilizara durante 5 minutos en cada posición después de girar la perilla. Un ciclo completo del proceso de calibración incluyó giros en el sentido de las agujas del reloj (Pout aumentó de 1 a 10 kPa) y giros en el sentido contrario a las agujas del reloj (Pout disminuyó de 10 a 1 kPa). Se utilizaron 15 ciclos completos para calibrar las lecturas de presión de salida frente a la posición de la perilla. Para cuantificar la estabilidad de las presiones reguladas, se recolectaron datos durante un período de 1000 min para tres presiones designadas (Pout = 1, 5 y 10 kPa), cubriendo los puntos de ajuste bajo, medio y alto del rango. Es importante tener en cuenta que para evitar la necesidad de una nueva calibración para diferentes configuraciones experimentales, utilizamos una gran resistencia fluídica (20 μm × 100 μm × 32 cm) después del regulador de presión. La resistencia fluídica ofreció una resistencia mucho mayor que los otros elementos aguas abajo y, por lo tanto, nos permitió quitar los sensores de flujo después del paso de calibración inicial sin necesidad de volver a calibrar. Este enfoque es equivalente a usar una alta impedancia de entrada para mantener una caída de voltaje en un sistema eléctrico.

El diseño detallado y la fabricación de la plataforma de la barrera se han descrito en nuestro trabajo anterior45,46. Brevemente, la plataforma de cultivo celular constaba de los microcanales superior e inferior, separados por una nanomembrana ultrafina (SiMPore Inc., Rochester, NY, EE. UU.). La nanomembrana tiene un espesor de 100 nm y un tamaño de poro de 60 nm. El dispositivo tiene un módulo central de pozo abierto conocido como m-µSiM que se puede reconfigurar en un dispositivo fluídico agregando un módulo de flujo en su pozo y sellándolo magnéticamente usando dos carcasas con imanes integrados. El módulo de flujo se fabricó utilizando el método estándar de litografía blanda y las carcasas se fabricaron con un cortador láser (serie H 20 × 12, Full Spectrum, CA, EE. UU.). Las dimensiones del canal superior eran h = 200 µm, w = 1,5 mm y l = 5 mm, y el canal inferior eran h = 150 µm, w = 2–6 mm y l = 15 mm. El flujo del depósito de medios se conectó a la entrada del canal superior mediante tubos y puntas de dosificación de 21 NT de calibre 21 (Jensen Global, EE. UU.).

Antes de su uso, el circuito de flujo se esterilizó exponiéndolo a la luz ultravioleta46. Dado que la bomba de aire se usó dentro de un entorno incubado y estéril, no se requirió más filtración del aire de salida. Antes de la siembra celular, la nanomembrana se recubrió con 5 µg cm−2 de fibronectina (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.) durante una hora a temperatura ambiente y luego se enjuagó con medio celular fresco. Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) se cultivaron en medio basal EBM-2 (Lonza Bioscience, Walkersville, MD, EE. UU.) complementado con EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit ( Lonza Bioscience, Walkersville, MD, EE. UU.) y se mantuvo en un matraz de cultivo de tejidos. Antes del uso, las células se disociaron usando TrypLE (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) durante 3 min y se centrifugaron a 150 G durante 5 min. Después de la resuspensión, las células se sembraron en la superficie de la membrana a través del microcanal superior y se incubaron durante 1 h para promover la unión celular.

El µPR se ajustó a una presión de salida de 8 kPa (∆P = 8 kPa), que correspondía a una tasa de flujo del medio de 1 µL min−1 (tensión de cizallamiento de 0,02 dinas cm−2 en la monocapa celular) en el canal superior para 24 horas Se usó la tinción VIVO/MUERTO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar la viabilidad celular según el protocolo del proveedor. Se tomaron imágenes de las células marcadas utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus IX-81 con el software CellSens (Olympus, Tokio, Japón) con configuraciones de captura de imágenes constantes en todos los conjuntos experimentales.

Se conectó un microcanal PDMS en forma de Y que constaba de dos canales de entrada de 1 cm de largo y un canal de salida de 1 cm de largo a dos µPR (P1 y P2) y dos microbombas alimentadas por batería. Cada µPR se conectó a un sensor de presión para medir la presión. P1 se mantuvo a 1,0 kPa mientras se variaba P2. Permitimos 30 s para cada etapa P2 para proporcionar una secuencia de presiones: 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa y 1,0 kPa, para un total de 3 min y 30 s. La interfaz líquido-líquido entre las corrientes de colores se registró con un microscopio estereoscópico SMZ-168 y su cámara (Motic Co., ltd., Xiamen, China). Los datos se informan como valor medio ± desviación estándar.

Los reguladores de presión se usan comúnmente en circuitos neumáticos para reducir el aire de alta presión a un punto de ajuste de presión controlable más bajo para aplicaciones aguas abajo. Al igual que con la mayoría de los reguladores de presión manuales, nuestro µPR impreso en 3D utiliza un mecanismo de equilibrio de fuerza y está diseñado para mantener un punto de ajuste definido por el usuario adecuado para sistemas microfluídicos estándar (~ 1–10 kPa). Como se muestra en la Fig. 2, el µPR consta de una cámara de aire de alta presión, una cámara de aire de baja presión y un componente de control de presión. La cámara de aire de alta presión incluye los resortes en voladizo de cierre (inferior), la válvula de asiento y la biela. Esta cámara recibe presión constante de una bomba de aire en miniatura. La cámara de baja presión con el diafragma sensor de presión emite la presión de salida regulada. El componente de control de presión consta de resortes voladizos superiores impresos en 3D y la perilla de control (un perno y una tuerca de emparejamiento), que se usa para controlar la presión de salida como se describe a continuación. El funcionamiento de µPR se puede describir en cuatro fases, como se muestra en la Fig. 3.

Esquema transversal de componentes esenciales en el µPR impreso en 3D. La cámara de alta presión (roja) recibe un suministro constante de aire a alta presión de una fuente externa. La cámara de baja presión (azul) expulsa aire a un valor constante de baja presión. La presión de salida se controla ajustando el componente de control de presión, que consta de resortes en voladizo y una perilla de control.

Representación de las cuatro fases del proceso de regulación de presión. Durante la Fase 1, el paso de aire está completamente cerrado, mientras suministramos aire desde una fuente de alta presión constante. En la Fase 2, el usuario gira la perilla de control para desplazar los voladizos superiores. A medida que aumenta la fuerza de restauración del voladizo superior (FT), el paso de aire entre las cámaras permanece cerrado. En la Fase 3, cuando FT supera un valor umbral, se abre el paso del aire. Finalmente, en la Fase 4, la presión en la cámara de aire de baja presión alcanza el nivel deseado establecido por la posición de la perilla de control y el paso se cerrará. Una vez que el usuario establece la presión, el dispositivo alterna entre la Fase 3 y la Fase 4 para mantener la presión de salida deseada.

Se suministra aire constante a alta presión a la cámara de alta presión mediante una bomba de aire en miniatura. Hay dos fuerzas de cierre presentes en esta etapa. La fuerza de presión de entrada (Fin) es una fuerza ascendente generada por la presión de entrada que actúa sobre el asiento. La fuerza del resorte voladizo de cierre (FC) es una fuerza ascendente constante generada por el desplazamiento de los resortes voladizos inferiores no ajustables y se establece durante el montaje. Estas fuerzas hacia arriba presionan el asiento contra el asiento y cierran el paso de aire entre las cámaras. En esta fase, la longitud del perno debajo de la tuerca es L y la punta del perno descansa contra el diafragma sensor de presión sin ejercer una fuerza hacia abajo.

A medida que giramos la perilla de control en el sentido de las agujas del reloj, la longitud del perno debajo de la tuerca aumenta a (L + ΔXT) y los resortes voladizos superiores se desplazan hacia arriba desde su estado relajado en (ΔXT). Este desplazamiento hacia arriba de los resortes en voladizo genera una fuerza de restauración hacia abajo (FT = kTΔXT) en el diafragma de detección. Durante esta fase, el paso del aire aún está sellado por fuerzas ascendentes (Fin y FC) porque FT < Fin + FC.

Cuando la perilla de control se gira más para aumentar ΔXT, FT supera las fuerzas ascendentes (Fin + FC) y la punta del perno desplaza el diafragma de detección de presión y la biela hacia abajo. El movimiento de la biela descoloca la válvula de asiento y abre el paso de aire, lo que permite que el aire a alta presión entre en la cámara de baja presión. La presión (Pout) en la cámara de baja presión ejerce una fuerza ascendente (Fout) sobre la superficie inferior del diafragma sensor de presión (área Ad), Pout = Fout Ad−1.

Pout aumenta hasta que la suma de Fout y otras fuerzas ascendentes Fin, FC es igual a FT como se muestra en la ecuación. (1). Estas fuerzas ascendentes empujan la válvula de asiento hacia el asiento y bloquean el flujo de aire entre las cámaras (Fig. 3). Esto permite configurar Pout cambiando la fuerza del resorte en voladizo superior (FT = kT ΔXT) ajustando la posición de rotación de la perilla de control. Dado que Pout se utiliza para presurizar un depósito o canal de fluido aguas abajo, Pout disminuye y el µPR vuelve a entrar en la Fase 3 para permitir que el aire a alta presión compense la pérdida de presión. Una vez que se establece ΔXT con la perilla de control, el µPR alterna entre las fases 3 y 4 para mantener un punto de referencia estable, Pout.

Aquí, la fuerza del resorte en voladizo superior FT = kTΔXT; kT es la constante de resorte del resorte en voladizo superior y ΔXT es el desplazamiento del resorte. La fuerza de presión de salida Fout = PoutAd; Pout es la presión de salida y Ad es el área del diafragma sensor. Fin es la fuerza de presión de entrada en el área expuesta del asiento, y FC es una fuerza de cierre constante de los resortes voladizos inferiores.

La ecuación (1) se simplifica porque los resortes voladizos de cierre en la cámara de alta presión no son ajustables y, por lo tanto, FC es una constante. Fin es constante mientras suministramos una presión de entrada constante a la cámara de alta presión. Debido a que tanto Fin como FC son constantes, podemos controlar Fout (por lo tanto, Pout) manipulando el FT aplicado al diafragma. FT se escala linealmente con el desplazamiento (ΔXT) de los resortes voladizos superiores, por lo tanto, podemos ajustar Pout ajustando la posición angular de la perilla de control. El video complementario S2 muestra una animación del proceso de regulación de la presión.

Un objetivo principal de nuestra plataforma de bombeo es proporcionar un control de presión ajustable mientras se mantiene una configuración portátil. Por lo tanto, seleccionamos una bomba de aire en miniatura alimentada por batería en lugar de una línea de aire comprimido o un cilindro presurizado como fuente externa de alta presión. Dado que nuestro µPR opera bajo el supuesto de una presión de entrada constante (consulte la ecuación (1)), primero confirmamos que la presión de la bomba de aire en miniatura se mantuvo estable con el tiempo. Funcionando a 3 V, la bomba mantuvo una presión estable (41 ± 0,02 kPa) en el transcurso de 5 días. A continuación, buscamos caracterizar la relación entre la posición angular de la perilla de control y la presión de salida resultante. Como se muestra en la Fig. 4a, giramos la perilla de control en incrementos de 15˚ (correspondientes al aumento o disminución de ΔXT en la Fig. 3) y medimos la presión de salida. Los datos revelaron dos pendientes distintas. En la primera región desde la posición 1 a la 9 (1,0–2,2 kPa), la pendiente fue de 0,15 kPa por incremento de 15° mientras que en la segunda región desde la posición 10 a la 20 (2,6–10 kPa) la pendiente fue de 0,70 kPa por cada 15 ° incremento. Estas diferentes pendientes pueden ser consecuencia de la compresibilidad de la junta tórica de sellado en la válvula de asiento. Es decir, la junta tórica puede estar parcialmente en contacto con el asiento de la válvula y limitar el flujo de aire entre las cámaras (posiciones 1 a 9). Con una mayor rotación (posiciones 10 a 20), la junta tórica se separa completamente del asiento de la válvula y el aire puede fluir entre las cámaras con menos resistencia, creando así una relación de pendiente más pronunciada.

(a) Presión de salida vs. posiciones de la perilla de control (pasos de 15º). Las presiones aumentaron en incrementos de 0,15 kPa entre las posiciones 1 y 9 (azul) y en incrementos de 0,70 kPa entre las posiciones 10 y 20 (rojo). (b) Prueba de estabilidad de la presión de salida con presiones establecidas en 1, 5 y 10 kPa, girando la perilla de control a las posiciones 1, 14 y 20, respectivamente, siguiendo los resultados calibrados en (a). La presión se midió durante 5 días para comprobar la estabilidad de la presión de salida regulada por el dispositivo. Las tres presiones de salida fueron 1,1 ± 0,01 kPa, 5,2 ± 0,11 kPa y 10,2 ± 0,20 kPa durante la prueba de estabilidad de 5 días.

Para garantizar un flujo controlado para las aplicaciones de cultivo, es importante proporcionar una caída de presión estable (∆P = Pout − Patm) en toda la red de microcanales. Aquí, la presión de salida (Pout) regulada por el µPR ayuda a establecer $\Delta P$. Usando los datos de calibración de la Fig. 4a, caracterizamos la estabilidad de Pout durante 5 días en tres puntos de ajuste diferentes, 1, 5 y 10 kPa. Como se muestra en la Fig. 4b, las presiones de salida fueron 1,1 ± 0,01 kPa (1,1 % de error), 5,2 ± 0,11 kPa (2,2 % de error) y 10,2 ± 0,20 kPa (1,9 % de error) y demostraron la capacidad de µPR para proporcionar ajustes y presiones estables en todo el rango de salida.

A continuación, exploramos cómo se podría usar el µPR para proporcionar una caída de presión estable a través de un canal de microfluidos y producir tasas de flujo prácticas para aplicaciones de cultivo celular. El µPR se diseñó para admitir caudales bajos que pueden ser difíciles de lograr con reguladores de presión comerciales (p. ej., 10–100 nL min−1). Los caudales se midieron en la Fig. 5 para diferentes presiones de salida para cuantificar la capacidad del µPR de controlar el flujo de líquido. Introdujimos caídas de presión, ∆P, de 1 a 8 kPa, utilizando el µPR y caudales medidos que oscilaron entre 8,50 y 98,7 nL min−1. Observamos una excelente correlación (R2 = 0,999) entre las simulaciones de COMSOL y las medidas experimentales de caudal (∆P de 1 a 8 kPa). La pendiente que describe la relación es 12 nL min−1 kPa−1.

El recuadro muestra la configuración de la prueba, incluido el regulador de presión que crea un ∆P en el microcanal. ∆P está determinado por la presión de salida de µPR y la presión atmosférica al final del microcanal. ∆P (1 a 8 kPa) cubre caudales de 8,50 a 98,7 nL min−1, con la relación descrita por la pendiente 12 nL min−1 kPa−1. La línea recta es la respuesta simulada de los caudales frente a las presiones manométricas de salida. R2 = 0,999 es la correlación entre los datos experimentales y los resultados de la simulación COMSOL.

En los sistemas de microfluidos, se requiere la perfusión de medios porque el volumen de medios en el canal, a escala de microlitros, se agota rápidamente de nutrientes por las células metabólicamente activas y debe reponerse para mantener la viabilidad celular. Para demostrar la compatibilidad de nuestro µPR para controlar el flujo de fluidos y mantener las células, usamos el µPR para establecer una monocapa endotelial en un modelo de barrera tisular que desarrollamos previamente46. Como se muestra en la Fig. 6a, la plataforma de cultivo consta de dos microcanales separados por una nanomembrana. El canal inferior se llenó con medios celulares mientras que el canal superior recibió flujos impulsados por el µPR. El µPR indujo una caída de presión estable de 8 kPa en el microcanal de cultivo superior, lo que resultó en un caudal constante de 1 µL min−1 para introducir los medios celulares desde el depósito a la región de cultivo.

( a ) Ilustración esquemática de la plataforma de cultivo celular. Una mini bomba de aire suministra aire a alta presión a µPR, lo que produce una caída de presión estable (ΔP) a través del microcanal superior de la plataforma. Esto da como resultado el flujo de medios celulares desde el reservorio hacia el microcanal. La plataforma consta de dos microcanales separados por una nanomembrana ultrafina. Los componentes de la plataforma se pueden desmontar después del experimento gracias a su mecanismo de enganche magnético reversible. Configuramos la salida de 8 kPa del µPR para impulsar el flujo de medios de cultivo (Q = 1 µL min−1). (b) Vista transversal de la monocapa endotelial y comparación de células cultivadas en (i) cultivo dinámico (con flujo) y (ii) cultivo estático (sin flujo). Las células se tiñeron con tinción LIVE/DEAD y las imágenes de fluorescencia se capturaron en verde (células viables) y rojo (células muertas). Esto demuestra que µPR puede impulsar un flujo continuo vital para el cultivo celular a largo plazo y la formación de una monocapa celular confluente. Barras de escala = 100 μm.

Como era de esperar, las células cultivadas en el dispositivo con flujo de medios impulsado por µPR se mantuvieron vivas y formaron una monocapa confluente después de 24 h, mientras que la mayoría de las células en el control estático murieron debido a la falta de suministro de medios celulares (Fig. 6b). La tinción viva/muerta mostró una tasa de supervivencia del 98 % en el dispositivo suministrado con µPR, mientras que el control estático (sin flujo de medios) tuvo una tasa de supervivencia del 38 %. Estos resultados confirmaron la capacidad de µPR para proporcionar velocidades de flujo estables y mantener un cultivo de células a largo plazo en dispositivos de microfluidos.

Dado que la presión de salida se puede cambiar fácilmente en función de la posición calibrada de la perilla de control, demostramos la capacidad de respuesta de µPR al cambio de presión en tiempo real. Como se muestra en la Fig. 7, mostramos cambios de paso dinámicos en la presión que abarcaron todo el rango de presión: (a) 1 kPa–5 kPa–1 kPa, (b) 5 kPa–10 kPa–5 kPa y (c) 1 kPa–10 kPa–1 kPa. En este experimento, nuevamente usamos los resultados de la calibración como se presenta en la Fig. 4a para los puntos de referencia de las posiciones de la perilla de control para las presiones utilizadas en este experimento. La Figura 7 muestra que nuestro µPR podría subir y bajar para alcanzar los puntos de referencia deseados en períodos de un minuto, incluso entre los patrones de presión dinámica más grandes del experimento.

Las respuestas dinámicas de los patrones de presión que incluyen (a) 1 a 5 a 1 kPa, (b) 5 a 10 a 5 kPa y (c) 1 a 10 a 1 kPa se logran girando la perilla de control con los datos de calibración en la Fig. 4a. Cada patrón presenta tres etapas, cada una con 200 s bajo la observación en tiempo real de la respuesta de presión dinámica.

Para resaltar la integración de múltiples µPR en un solo sistema, utilizamos dos µPR para controlar por separado las velocidades de flujo de dos líquidos dentro de un canal de microfluidos en forma de Y y visualizamos la posición de equilibrio dinámico de la interfaz de flujo laminar de doble flujo mientras ajustamos un µPR a un nuevo punto de consigna. Alimentamos agua desionizada teñida de rojo al puerto de entrada superior del canal Y con la presión establecida en 1,0 kPa µPR, P1. Se alimentó agua desionizada teñida de azul en el puerto de entrada inferior con presión regulada por un segundo µPR, P2; estos valores de presión se cambiaron durante el experimento desde un rango de 1,0 kPa a 1,8 kPa.

Como era de esperar, cuando P1 = P2, la interfaz líquido-líquido entre las corrientes roja y azul se ubicaba en la línea media del canal (línea discontinua blanca), lo que confirma la capacidad de brindar caudales estables utilizando múltiples µPR. A medida que cambiamos P2 de 1,0 a 1,8 kPa girando la perilla de control, la tasa de flujo en el canal inferior aumentó y la interfaz se desplazó hacia arriba (consulte la Fig. 8 y el video complementario S3, que se muestra a una velocidad de 8x). Permitimos un período de tiempo de observación de 30 s para cada nuevo punto de ajuste de P2 con la siguiente secuencia de presiones: 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa y 1,0 kPa, para un total de 3 min y 30 s. La interfaz líquido-líquido se desplazó en respuesta al ajuste de presión P2, se asentó rápidamente en la nueva posición y mantuvo la estabilidad durante cada uno de los períodos de monitoreo de presión de 30 s. La respuesta dinámica del ajuste de flujo µPR demostró un ajuste de presión en tiempo real y posiciones estables de equilibrio dinámico. Destacamos las capacidades de control de presión del sistema y las posibilidades de perfil de flujo para características más avanzadas en tiempo real que requieren controles de presión.

Observación en tiempo real del flujo de líquido colaminar presurizado con dos µPR. µPR #1 suministra presión (P1) a un puerto de entrada del canal de observación de flujo laminar, mientras que µPR #2 suministra presión (P2) al otro. P1 se ajustó a 1 kPa, mientras que P2 se ajustó a (a) 1,0 kPa, (b) 1,3 kPa, (c) 1,5 kPa y (d) 1,8 kPa usando la perilla de control. Barra de escala = 1 mm.

El objetivo de nuestra plataforma es proporcionar un método de control de flujo de microfluidos portátil y simplificado al tiempo que proporciona flujos estables adecuados para aplicaciones de cultivo celular. Si bien existen soluciones comerciales para el control de la presión neumática, estos reguladores de presión tienen un tamaño más grande (> 30 mm), un rango de presión de salida más alto (~ 35 kPa) con una resolución más baja (> 3,5 kPa). Estos enfoques tampoco se pueden personalizar, son costosos (> $ 100 USD por uno con las características mencionadas anteriormente) y requieren una línea de aire comprimido de laboratorio dedicada. Estas técnicas se resumen en la Tabla S2. Al presentar el µPR junto con una mini bomba de aire para crear una plataforma de control de flujo de microfluidos, podemos ofrecer una gama de caudales ajustables y estables dentro de un sistema portátil. Nuestra plataforma proporciona un esquema de control de presión rentable con una gama de oportunidades de personalización debido a la creciente disponibilidad de impresoras 3D comerciales y de aficionados. Como referencia, el costo total de la minibomba de aire y la configuración de µPR, como se muestra en este trabajo, es inferior a $7 USD, de los cuales el µPR es inferior a $1,20, como se muestra en la Tabla S1 complementaria.

En nuestro diseño (ver Figs. 2 y 3), el mecanismo de regulación de presión es similar al de los reguladores de presión convencionales. Sin embargo, al incorporar técnicas de impresión 3D, pudimos integrar dos conjuntos de resortes en voladizo como alternativa a los grandes resortes comerciales para simplificar el ensamblaje y ayudar a miniaturizar el dispositivo. Al incorporar resortes voladizos en el diseño de la válvula de asiento, creamos una fuerza de cierre hacia arriba (FC), como se muestra en la Fig. 3, para evitar posibles fugas de aire de alta presión a la cámara de baja presión a través del paso de aire. Este diseño "normalmente cerrado" permite a los usuarios cerrar la presión de salida y desconectar momentáneamente los compartimentos de cultivo celular para su inspección o modificación. Dado que la regulación de Pout depende de las acciones de cierre de la válvula de asiento, elegimos juntas tóricas elastoméricas impermeables al gas (Shore 60A) en el asiento para un mejor sellado. Esto se adapta a nuestras aplicaciones objetivo, que a menudo funcionan con un régimen de baja presión y bajo caudal. Para apuntar al rango de 1 a 10 kPa, elegimos el perno de tamaño M2 (0,4 mm de paso, 2 mm de diámetro) como la perilla de control con un dial de 24 posiciones. Esta combinación proporciona una resolución de presión suficiente (< 1 kPa por giro de 15°) al mismo tiempo que conserva un control fácil de usar. Al ajustar algunos parámetros mecánicos clave, como kT y Ad, podemos lograr diferentes rangos de presión de salida objetivo. La ecuación (2) muestra que kT se puede modificar cambiando las propiedades mecánicas del voladizo cambiando a un material diferente o cambiando la configuración de curado de la impresora 3D. kT también puede verse alterado por la geometría de los voladizos. Por ejemplo, podemos aumentar la sensibilidad a la presión cuando disminuimos kT, lo que se puede lograr aumentando la longitud de los resortes en voladizo o disminuyendo su ancho o espesor, como se muestra en la Ec. (2).

donde E es el módulo de Young del material impreso en 3D y b, h, l son el ancho, el grosor y la longitud de cada voladizo, respectivamente.

Aunque kT es más sensible a los cambios en el grosor (h) del voladizo que el ancho (b) (ver Ec. (2)), la precisión z (es decir, el control del grosor de la capa) de la impresora 3D es a menudo menor que la ejes x-y, lo que resulta en una mayor variabilidad en el espesor51. Por ejemplo, un cambio de espesor de 0,1 mm (de 0,5 a 0,6 mm) de los resortes en voladizo puede resultar en un aumento del 70 % en la constante del resorte. Anticipamos que el µPR impreso en 3D se puede modificar para adaptarse a diferentes rangos de presión según las descripciones matemáticas. Por ejemplo, aumentar el área del diafragma de detección Ad puede mejorar la resolución del punto de ajuste de la presión de salida, pero da como resultado una huella más grande del dispositivo y un límite superior más pequeño (restringido por la fuerza máxima del resorte en voladizo) de la presión de salida, ya que la fuerza de salida escala linealmente con el área del diafragma pero está limitada por la fuerza del resorte en voladizo superior.

Fabricamos nuestro dispositivo apilando componentes impresos en 3D con una junta tórica como componente de sellado clave para separar las cámaras de alta y baja presión de aire. Se pueden usar impresoras 3D de múltiples materiales para imprimir este dispositivo en un solo paso de fabricación con piezas rígidas y flexibles para un sellado sólido, pero es posible que estas impresoras no estén disponibles en todos los laboratorios. Para las impresoras de un solo material, las técnicas de impresión-pausa-impresión podrían permitir la colocación de materiales blandos para el sellado durante la fabricación, pero agregarían complejidad e incertidumbre a la fabricación52. Dado que las estructuras impresas en 3D todavía están asociadas con errores dimensionales para características de dispositivos tan pequeños, cada dispositivo debe calibrarse para determinar la relación entre la posición de la perilla y la presión de salida con las ecuaciones matemáticas que sirven como pautas generales de diseño. La relación entre las posiciones de las perillas de control y las presiones de salida, una vez calibradas, se puede usar para producir la presión de salida deseada en otras aplicaciones. El µPR no entra en contacto con fluidos y puede reutilizarse según sea necesario. La configuración compacta y fácil de la plataforma de control de flujo de microfluidos basada en µPR proporciona un control manual de ΔP basado en la calibración. Dado que la plataforma de control de flujo depende de la caída de presión para lograr las tasas de flujo requeridas, utilizamos un sistema abierto (presión en la salida del canal = Patm) para limitar los efectos de la contrapresión. Durante el experimento de cultivo celular, pudimos suministrar un caudal constante de medios a la plataforma de cultivo para mantener un entorno viable para las HUVEC en comparación con la situación sin flujo. Para redes microfluídicas más complicadas o sistemas cerrados, los usuarios pueden agregar reguladores de contrapresión para elevar el umbral de presión aguas abajo al final de la red microfluídica para evitar posibles contraflujos; sin embargo, esto requeriría un rango más alto de presiones impulsoras para entregar el mismos caudales26,53.

Con la capacidad de control dinámico demostrada con los flujos co-laminares, presentamos más posibilidades en el control dinámico de la presión de salida para introducir diferentes tasas de flujo de medios para cambios de configuración de cultivo utilizando nuestro µPR (por ejemplo, ajuste de tensión de corte para fines de alineación celular) sin modificar el geometría del canal. A diferencia de las bombas de jeringa y las soluciones neumáticas comerciales, el tamaño reducido y los requisitos mínimos de equipo periférico del sistema basado en µPR y se mueven fácilmente dentro y fuera de una incubadora de cultivo celular. Aunque este trabajo se centra en la creación de una plataforma de cultivo celular simple, sintonizable y fácil de usar para tasas de flujo constantes únicas, las funcionalidades de control de flujo automatizado, incluidos los flujos de rampa controlados o pulsados, podrían introducirse utilizando un motor paso a paso y un tren de engranajes para programar ajustes. a las posiciones de las perillas.

En resumen, presentamos µPR impresos en 3D miniaturizados, fáciles de fabricar y de bajo costo, y destacamos capacidades de control de presión estable relevantes para muchas aplicaciones de microfluidos. También demostramos que la plataforma de bombeo y µPR podría usarse para mantener las células en un entorno de cultivo de microfluidos basado en membranas compartimentado. Anticipamos que nuestras técnicas de fabricación simples y archivos de diseño de acceso abierto permitirán que otros laboratorios personalicen µPR para admitir una amplia gama de aplicaciones de microfluidos donde las bombas de jeringa o los métodos neumáticos tradicionales son difíciles o inconvenientes de integrar.

Todos los datos están disponibles a pedido razonable. Los archivos de diseño CAD del regulador de presión están disponibles en https://abhyankarlab.org.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud bajo los números de concesión 1R43GM137651 y 1R61HL154249. Los autores agradecen a Xian Boles por su apoyo en la ilustración ya Nathan Tangeman en RIT por su apoyo fotográfico.

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Instituto de Tecnología de Rochester, Rochester, NY, 14623, EE. UU.

Meng-Chun Hsu y David A. Prestatario

Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Tecnología de Rochester, Rochester, NY, 14623, EE. UU.

Meng-Chun Hsu, Mehran Mansouri, Nuzhet NN Ahmed, Stephen M. Larson, Indranil M. Joshi, Adeel Ahmed y Vinay V. Abhyankar

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MC.H., DAB y VVA conceptualizaron el trabajo, MC.H. diseñó y construyó el sistema, MC.H., MM, AA, NNNA, IMJ y SML realizaron experimentos, MC.H. y MM analizaron los resultados. MC.H. y VVA escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Vinay V. Abhyankar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hsu, MC., Mansouri, M., Ahamed, NNN y col. Un regulador de presión impreso en 3D (µPR) miniaturizado para aplicaciones de cultivo celular microfluídico. Informe científico 12, 10769 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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Recibido: 15 Abril 2022

Aceptado: 17 junio 2022

Publicado: 24 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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