El establecimiento de organoides de la EPOC para estudiar el huésped.

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7635 (2022) Citar este artículo

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La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por limitación del flujo de aire y exacerbaciones infecciosas; sin embargo, faltan sistemas modelo in vitro para el estudio de la interacción huésped-patógeno a nivel individual. Aquí, describimos el establecimiento de organoides nasofaríngeos y bronquiales de individuos sanos y EPOC que recapitulan la enfermedad a nivel individual. A diferencia de los organoides sanos, en los organoides de la EPOC se observaron hiperplasia de células caliciformes y reducción de la frecuencia de latidos ciliares, características distintivas de la enfermedad. La transcriptómica unicelular descubrió pruebas de trayectorias de diferenciación celular alteradas en los organoides de la EPOC. La infección por SARS-CoV-2 de los organoides de la EPOC reveló una replicación más productiva en los bronquios, el sitio clave de infección en casos graves de COVID-19. La exposición viral y bacteriana de los organoides indujo mayores respuestas proinflamatorias en los organoides de la EPOC. En resumen, presentamos un modelo organoide que recapitula el microambiente pulmonar fisiológico in vivo a nivel individual y es susceptible de estudiar la interacción huésped-patógeno y las enfermedades infecciosas emergentes.

La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) es una enfermedad respiratoria inflamatoria crónica de alta morbimortalidad global1. Se caracteriza por el desarrollo de una limitación progresiva e irreversible del flujo aéreo, endofenotipos heterogéneos y diferentes trayectorias de la enfermedad entre pacientes individuales2,3. Los pacientes sufren síntomas respiratorios persistentes y progresivos, deterioro de la función pulmonar, anomalías pulmonares estructurales y exacerbaciones4. Los pacientes con EPOC también muestran una mayor prevalencia de comorbilidades en desarrollo, como enfermedades cardiovasculares, que se asocian con peores resultados clínicos y mayores riesgos de mortalidad5. Dado que ahora se reconoce ampliamente la complejidad y heterogeneidad de la EPOC entre pacientes individuales, la investigación basada en células sigue siendo un gran desafío debido a la falta de modelos experimentales adecuados que recapitulen la enfermedad a nivel individual6,7. Se han utilizado modelos de animales pequeños, incluidos ratones, cobayas y conejos, para estudiar la EPOC; sin embargo, no pueden recapitular la genética y la epigenética de la enfermedad humana, necesitan que se induzca la EPOC y, una vez establecidos, no necesariamente imitan todo el espectro clínico de los endofenotipos observados. en pacientes individuales8,9. Por lo tanto, establecer modelos celulares de próxima generación que superen tales limitaciones y tengan en cuenta la variación individual será fundamental para comprender mejor los mecanismos moleculares que sustentan las respuestas a la infección y el tratamiento a nivel individual en la EPOC, lo que permitirá la aplicación de la medicina de precisión basada en el banco.

Para facilitar estos estudios personalizados, es fundamental desarrollar modelos in vitro fácilmente accesibles que reproduzcan el microambiente de las vías respiratorias en la EPOC a nivel individual. Hasta la fecha, sigue faltando modelos experimentales adecuados para el estudio de la interacción huésped-patógeno en la EPOC. La última década ha sido testigo de importantes avances en la generación de organoides derivados de células madre, que incorporan múltiples tipos de células dentro de una arquitectura tridimensional10. Los organoides representan una herramienta de laboratorio para recapitular las características funcionales específicas de tejido de su respectivo órgano y facilitar el estudio de la interacción huésped-patógeno. Se han generado con éxito modelos organoides de pulmón humano, que reproducen la organización epitelial de su respectiva región anatómica, a partir de tejidos nasales11,12, bronquiales13 y alveolares14,15 utilizando células madre adultas o pluripotentes como materiales de partida16,17,18. Los organoides pulmonares se han utilizado para estudiar el cáncer de pulmón13,19 y la fibrosis quística13 y para evaluar la infección, incluido el virus respiratorio sincitial (RSV)13, el enterovirus20, el criptosporidio21, la influenza22,23 y, recientemente, el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) 24,25,26. Los datos clínicos y epidemiológicos indican que la EPOC se asocia con resultados graves de COVID-19, incluido un mayor riesgo de hospitalización y muerte, aunque faltan mecanismos impulsores27,28,29,30,31,32,33,34.

Aparte de la infección viral, la infección bacteriana representa una proporción significativa de las exacerbaciones en la EPOC, y las especies predominantes aisladas incluyen Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa35.

Aquí, mostramos el establecimiento y la caracterización de los organoides pulmonares de la EPOC y los aplicamos al estudio de la interacción huésped-patógeno, incluidos el SARS-CoV-2 y Pseudomonas aeruginosa. Nuestros modelos de organoides de EPOC recapitulan el microambiente pulmonar fisiológico in vivo y dan como resultado respuestas inflamatorias elevadas a infecciones virales y bacterianas.

Los organoides nasofaríngeos y bronquiales humanos primarios (NPO y BO, respectivamente) se establecieron mediante métodos informados anteriormente con modificaciones (Fig. 1a) 13. Un organoide bien diferenciado de las vías respiratorias desarrolla un único o, en ocasiones, varios lúmenes revestidos por células cilíndricas, caliciformes y cilíndricas. Las células basales están ubicadas en el exterior y los cilios móviles que facilitan el remolino de moco se visualizaron hacia el interior (Fig. 1b, c, Fig. 1 complementaria y Video complementario 1). La tinción de inmunofluorescencia de organoides no enfermos demostró marcadores celulares para la proteína tumoral 63 (TP63) + células basales, secretoglobina Familia 1 A Miembro 1 (SCGB1A1) + células club, acetilado-α-tubulina (Ac-tubulina) + células ciliadas y mucina 5AC (MUC5AC) + células caliciformes tanto en NPO como en BO (Fig. 1b, c, Fig. 1 complementaria). Se observaron marcadas diferencias entre los NPO y los BO, en particular, los BO estaban más ciliados con extensas estructuras de cilios Ac-tubulina + y una mayor expresión del gen FOXJ1 (Fig. 1b, c, Fig. 1 complementaria). La PCR cuantitativa (qPCR) confirmó que los BO expresan TP63, SCGB1A1 y FOXJ1 significativamente más altos en comparación con los NPO, aunque se detectó una expresión similar de MUC5AC entre los NPO y los BO (Fig. 1d-g).

a Ilustración esquemática del aislamiento de células epiteliales bronquiales y nasofaríngeas humanas primarias y la generación de organoides humanos. b Tinción de inmunofluorescencia de organoides nasofaríngeos humanos (NPO) (vías respiratorias superiores) para TP63 (células basales: verde), SCGB1A1 (células club: púrpura), tubulina-α acetilada (Ac-tubulina) (células ciliadas: verde) y MUC5AC ( células caliciformes: púrpura). Los núcleos y la actina F se contrastan con DAPI (azul) y faloidina (rojo/blanco), respectivamente. Barra de escala = 20 μm. C. Tinción de inmunofluorescencia de organoides bronquiales humanos (BO) (vías respiratorias inferiores). Barra de escala = 20 μm. Los datos en bc son representativos de al menos 5 experimentos independientes. Análisis d-g qRT-PCR del ARN total extraído de NPO y BO para (D) TP63 (células basales), (E) SCGB1A1 (células club), (F) FOXJ1 (células ciliadas) y (G) MUC5AC (células caliciformes) ). Se ilustran n = 7 y n = 3 experimentos biológicamente independientes para NPO y BO, respectivamente. Los datos se presentan como medianas ± rango intercuartílico y se realiza la prueba U de Mann-Whitney. *P < 0,05 [TP63 = 0,0333; SCGB1A1 = 0,0238; FOXJ1 = 0,0238]. HNPEC: células epiteliales nasofaríngeas humanas; BALF: Líquido de lavado broncoalveolar; HBEC: Células epiteliales bronquiales humanas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los NPO y BO derivados de sujetos con EPOC (GOLD etapa B, C y D) contienen todos los tipos de células observados en organoides no enfermos (Fig. 2a, b, Fig. 1 complementaria). Una mayor abundancia de células caliciformes era característica de los organoides de la EPOC, incluida una expresión del gen MUC5AC significativamente elevada en la EPOC en comparación con las NPO no enfermas (Fig. 2a-c). En los BO de la EPOC, las poblaciones de células club y ciliadas disminuidas eran evidentes, características del estado de la enfermedad (Figuras complementarias 1, 2b, c). Cuando los organoides de la EPOC se estratificaron por exacerbaciones en sus donantes, una frecuencia creciente de exacerbaciones se relacionó significativamente con una mayor expresión del gen MUC5AC en su respectivo cultivo de organoides (Fig. 2d). Se observa una estrecha relación con la función pulmonar, donde aquellos con la función pulmonar más pobre (<30 % FEV1 % predicho) demuestran la mayor expresión del gen MUC5AC, ejemplificado además por una relación inversa significativa entre la expresión del gen MUC5AC y el % FEV1 predicho (R = - 0,5890, p = 0,0008, figura 2e, f). Es importante destacar que esta asociación celular con los correlatos clínicos de la EPOC no se extiende a otros tipos de células presentes en el modelo organoide (Fig. 2 complementaria). La EPOC muestra un aclaramiento mucociliar alterado que predispone a la infección, y la presencia de dicha disfunción se evaluó en los BO derivados de EPOC y no enfermos mediante imágenes de tomografía de coherencia microóptica (µOCT). Los BO demostraron una visualización clara de los cilios funcionales, y la frecuencia de latido ciliar (CBF) fue significativamente menor en los BO con EPOC en comparación con los no enfermos (Fig. 2g, h y video complementario 2).

a Tinción de inmunofluorescencia de organoides nasofaríngeos humanos (NPO) y b Organoides bronquiales humanos (BO) derivados de individuos no enfermos (izquierda) y pacientes con EPOC (derecha) para MUC5AC (púrpura). El panel superior ilustra el exterior del organoide mientras que el panel inferior ilustra el lumen del organoide. Barra de escala = 20 μm. Los datos en ab son representativos de al menos 5 experimentos independientes. c Análisis qRT-PCR del ARN total extraído de NPO y BO derivados de individuos no enfermos (ND) y pacientes con EPOC para MUC5AC. La ND y la EPOC de los estadios GOLD B, C y D se indican con símbolos negros, azules, amarillos y verdes, respectivamente. n = 7; n = 10; n = 3 y n = 8 experimentos biológicamente independientes para NPO-ND; NPO-EPOC; Se ilustran BO-ND y BO-COPD. Los datos se presentan como medianas ± rango intercuartílico y se realizó la prueba U de Mann-Whitney. *** P < 0,001. [NPO-ND vs NPO-COPD = 0,0004] d Expresión del gen MUC5AC en NPO y BO derivados de ND y EPOC, este último estratificado por frecuencia de exacerbación como no exacerbador (NE); exacerbador (E) y exacerbador frecuente (FE). Se ilustran n = 28 muestras biológicamente independientes. Los datos se presentan como medianas ± rango intercuartílico y se realiza la prueba U de Mann-Whitney. *P < 0,05; ****P < 0,0001. [ND frente a NE = 0,0117; ND frente a E < 0,0001; ND frente a FE < 0,0001]. e Función pulmonar como volumen espiratorio forzado en el primer segundo porcentaje previsto (FEV1 % previsto). Se ilustran n = 28 muestras biológicamente independientes. Los datos se presentan como medianas ± rango intercuartílico y se realizó la prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001; **** P < 0,0001. [ND frente a 50–79 %=0,0003; ND vs 30-49% <0,0001; ND vs <30% <0,0001]. f Gráfico de dispersión que correlaciona la expresión del gen MUC5AC en organoides de la EPOC según el % de FEV1 previsto. Se ilustran n = 28 muestras biológicamente independientes. Se realizó el análisis del coeficiente de correlación de Spearman (no paramétrico). P = 0,0008. g Imágenes representativas capturadas mediante imágenes de tomografía de coherencia microóptica (μOCT) de organoides bronquiales de ND y EPOC a 0 y 14 s (s). Barra de escala = 50 μm. Los datos en g son representativos de 3 experimentos independientes. h Cuantificación de la medición de la frecuencia de batido ciliar (CBF) en Hertz (Hz) de organoides bronquiales derivados de ND (n = 3) y EPOC (n = 3). Se evalúan de 6 a 10 organoides por donante en hasta 10 regiones de actividad ciliar por secuencia de imágenes para determinar el CBF. Los datos se presentan como medianas ± rango intercuartílico y se realiza la prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001 [P = 0,0008]. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los transcriptomas de una sola célula demuestran que nuestros organoides pulmonares in vitro recapitulan fielmente las principales poblaciones de células que se encuentran en las vías respiratorias nativas in vivo, incluidas las células basales cíclicas, las células basales, las células club, las células caliciformes y las células epiteliales ciliadas (Fig. 3a, Figura complementaria 3a ) tanto en NPO como en BO (Fig. 3c, d complementaria). Aunque en un tamaño de muestra pequeño, este resultado está en línea con nuestro análisis de inmunofluorescencia y qPCR como se ilustra (Figs. 1, 2). Las identidades de las células se anotaron en función de los conjuntos de genes característicos de las células pulmonares y de las vías respiratorias derivados de García et al. (2019) y Travaglini et al. (2020) utilizando genes marcadores para cada grupo celular respectivo36,37 (Datos complementarios 1). Confirmamos además las identidades celulares utilizando genes marcadores específicos, por ejemplo, MKI67 para células basales en ciclo, TP63 y KRT5 para células basales, SCGB1A1 para células club, MUC5AC para células caliciformes y FOXJ1 para células epiteliales ciliadas (Fig. 3b complementaria). Se detectó un solo grupo menor que comprende ~ 1,4% del total de células, lo que demuestra solo la expresión de KRT5 y, por lo tanto, las clasificamos de manera conservadora como "células epiteliales". En comparación con los organoides no enfermos, los organoides de la EPOC demostraron menos células epiteliales basales cíclicas (5,4 % frente a 16,0 %) y ciliadas (3,2 % frente a 5,2 %), pero más células basales (45,7 % frente a 35,6 %) y caliciformes (15,9 % frente a 11,5 %). %). Las poblaciones de células club fueron comparables (29,4% frente a 29,3%) (Fig. 3b). La mayor abundancia de células caliciformes y la menor proporción de células ciliadas son indicativas de hiperplasia de células caliciformes y anomalías ciliares características de la EPOC.

a Los gráficos UMAP de datos transcriptómicos de scRNA-seq resaltan los principales tipos de células detectados en organoides pulmonares de pacientes no enfermos (ND) (izquierda; n = 8614 células) (agrupación de una línea NPO-ND y una línea BO-ND) y EPOC (derecha; n = 11.263 celdas) (agrupación de una línea NPO-COPD y una línea BO-COPD). b Gráficas de barras apiladas de la abundancia relativa de los nueve tipos de células principales en organoides de ND y EPOC. c Análisis de pseudotiempo de ND (arriba) y organoides de EPOC (abajo) que ilustran la trayectoria variable del ciclo de células basales en linajes de células ciliadas y caliciformes. d Mapa de calor que ilustra el patrón de expresión alterado, basado en marcadores específicos del tipo de célula, en organoides de ND y EPOC. Las células están ordenadas por su respectivo estado de enfermedad: ND o EPOC, tipo de célula, pseudotiempo e ilustradas por nivel de expresión mediante las claves de color proporcionadas. e Gráficos de barras que ilustran las principales vías canónicas de Ingenuity Pathway Analysis (IPA) enriquecidas derivadas de genes expresados ​​diferencialmente de EPOC a organoides ND para células basales, club y caliciformes, respectivamente. La puntuación z de la actividad pronosticada de IPA está codificada por colores (rojo: activación; azul: inhibición; gris: sin patrón de actividad disponible).

A continuación, evaluamos los conjuntos de datos de RNAseq a granel disponibles públicamente derivados de las vías respiratorias pequeñas en la EPOC (GSE162154) y comparamos el perfil de expresión de los DEG con los observados en el análisis pseudobulk de nuestros datos de scRNAseq. La agrupación jerárquica revela distintos grupos de muestras sanas y con EPOC. Las vías funcionales clave detectadas en los organoides de la EPOC, incluida la disfunción mitocondrial, el estrés del retículo endoplásmico, la reorganización del cilio, la remodelación de la matriz extracelular y la señalización de citoquinas proinflamatorias, fueron comunes tanto al análisis pseudobulk como a los conjuntos de datos públicos (Figuras complementarias 4b, c). Las células basales de los organoides de la EPOC demuestran un patrón funcional altamente consistente que no se observa en otros tipos de células y exhiben una trayectoria de desarrollo alterada de células basales cíclicas en linajes de células caliciformes y ciliadas (Fig. 3c). La gran abundancia de células basales en las vías respiratorias y en los organoides puede provocar una subrepresentación de otros tipos de células en el análisis de RNAseq a granel. Esto se refleja en las similitudes funcionales observadas entre los transcriptomas de células basales de organoides pulmonares y los conjuntos de datos de EPOC RNAseq a granel de acceso público (Fig. 4c complementaria).

La captura de transcriptomas con resolución unicelular en organoides de la EPOC permite la evaluación del cambio funcional asociado con tipos de células menores, inapreciable por RNAseq a granel. Se identificaron dos subpoblaciones, cada una de células basales, club y caliciformes, con una abundancia significativamente diferente entre los organoides no enfermos y los de la EPOC, donde los organoides de la EPOC están sobrerrepresentados por los siguientes grupos: Células basales 2 (35,3% frente a 4,7%), Club células 2 (15,6 % frente a 1,2 %) y células caliciformes 2 (10,4 % frente a 0,7 %), ninguna de las cuales se observa en organoides no enfermos (Fig. 3b-d). Los grupos de células basales 2 y células Club 2 también representan el tipo de célula intermedia predominante observado en la trayectoria de desarrollo alterada de las células basales en los organoides de la EPOC (Fig. 3b-d). Los organoides de la EPOC demuestran una transición alterada de un tipo de célula a otro en comparación con los organoides no enfermos (Fig. 3c, d). Esto se evidencia por una clara pérdida de la expresión del gen marcador en las células basales 2, las células Club 2 y las células caliciformes 2, todas sobrerrepresentadas en los organoides de la EPOC y su expresión detectable de genes marcadores de otros tipos de células (Fig. 3b-d, Figuras complementarias 3d, 4a). En conjunto, esto sugiere una diferenciación puntuada de células de los organoides de la EPOC, probablemente atribuible a la patogénesis de la EPOC.

Para interrogar aún más las vías funcionales que difieren entre los organoides no enfermos y los de la EPOC, evaluamos las diferencias funcionales entre las células basales, del club y caliciformes de cada modelo de organoides. Los tres tipos de células en los organoides de la EPOC demuestran la perturbación de vías canónicas similares (Fig. 3e). En las células basales y club, la vía EIF2 y la fosforilación oxidativa se activaron notablemente, mientras que la señalización de sirtuinas se suprimió levemente. Se observaron tendencias inversas en las células caliciformes. Independientemente, los análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) capturaron trastornos similares, pero además descubrieron la activación de células inmunitarias en los tres tipos de células de las vías respiratorias (Fig. 4d complementaria).

Nuestros organoides de pulmón humano derivados son aptos para el estudio de la interacción huésped-patógeno. Para facilitar tales estudios de infección y permitir el acceso directo del microorganismo infectante a la población de células luminales, los NPO y los BO se reorientaron para lograr una polaridad apical hacia afuera (Fig. 4a, b). Los organoides con cilios orientados hacia afuera se diferenciaron dentro de las 72 h en suspensión y las células basales se colocaron en el interior del organoide sin un lumen visible. Los cilios funcionalmente competentes, ahora orientados hacia afuera, inducen la autorrotación de toda la estructura organoide (video complementario 3).

un diagrama esquemático que describe el flujo de trabajo metodológico para la infección por SARS-CoV-2 de NPO y BO. b Representación pictórica de los organoides de las vías respiratorias 'basal-out' y 'apical-out' (arriba) y tinción de inmunofluorescencia de NPO en polaridad 'basal-out' y 'apical-out' para TP63 (células basales: rojo) y Ac-tubulina (células ciliadas: verde) (abajo). Barra de escala = 20 μm. c Tinción de inmunofluorescencia de NPO y BO derivados de individuos no enfermos para ACE2 (verde). Barra de escala = 20 μm. Los datos en bc son representativos de al menos 5 experimentos independientes. d–e Cinética de replicación viral de sobrenadantes de cultivo recolectados de (d) NPO y (e) BO infectados con SARS-CoV-2 a las 1, 24, 48, 72 y 96 h después de la infección (hpi) mediante el ensayo TCID50. n = 4 y n = 3 experimentos biológicamente independientes para NPO y BO, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± SEM y se realiza ANOVA unidireccional. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 [NPO: 48 hpi: L-WU frente a O-614D = 0,0005; G-614G frente a O-614D = 0,0002; 72 hpi: L-WU frente a O-614D = 0,0170; G-614G frente a O-614D = 0,0006; 96 hpi: L-WU frente a G-614G = 0,0041; G-614G frente a O-614D = 0,0011; BO: 24 hpi: L-WU frente a O-614D = 0,0070; G-614G frente a O-614D = 0,0065; 48 hpi: G-614G frente a O-614D = 0,0048]. f–g qRT-PCR del ARN total extraído de (f) NPO y (g) BO infectados con SARS-CoV-2 respectivamente a 48 y 72 hpi para interleucina-6 (IL-6), interferón-β (IFN-β) , ligando 10 de quimiocinas con motivo CXC (CXCL10) y factor de necrosis tumoral-α (ΤΝF-α). Se ilustran n = 3 experimentos biológicamente independientes. Los datos se presentan como medias ± SEM y se realiza ANOVA unidireccional. *P < 0,05; ** P < 0,01. [NPO: IFN-β: MK frente a G-614G = 0,0399; G-614G frente a O-614D = 0,0484; CXCL10: 48 hpi: MK frente a L-WU = 0,0156; 72 hpi: MK frente a L-WU = 0,0259; MK frente a G-614G = 0,0018; G-614G frente a O-614D = 0,0017; L-WU frente a O-614D = 0,0236; ΤΝF-α: 48 hpi: MK frente a G-614G = 0,0254; L-WU frente a G-614G = 0,0069; G-614G frente a O-614D = 0,0098; 72 hpi: MK frente a G-614G = 0,0374; L-WU frente a G-614G = 0,0062] [BO: IL-6: MK frente a G-614G = 0,0054; L-WU frente a G-614G = 0,0282; G-614G frente a O-614D = 0,0066; IFN-β: MK frente a G-614G = 0,0055; L-WU frente a G-614G = 0,0185; G-614G frente a O-614D = 0,0092] L-WU: cepa Clade L-Wuhan; G-614G: cepa Clade G y O-614D: cepa Clade O. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los NPO y BO de personas no enfermas y EPOC expresan ACE2, TMPRSS2, furina y neuropilina-1, todos los cuales desempeñan funciones clave en la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 5a-d complementaria). Es de destacar que la expresión génica de ACE2, TMPRSS2 y neuropilina-1 fue significativamente mayor en las vías respiratorias inferiores en donantes no enfermos sin diferencias entre las vías respiratorias superiores e inferiores en la EPOC (Fig. 5a-d complementaria). ACE2 se detectó en NPO y BO ajenos a su polaridad y no relacionados con el tipo o distribución celular (Fig. 4c). Nuestro análisis de células individuales revela que ACE2 se expresa en varios tipos de células, y TMPRSS2 fue generalizado en la mayoría de los tipos de células, especialmente en las células epiteliales ciliadas, mientras que la furina se colocalizó en gran medida con neuropilina-1 (Fig. 6 complementaria). Curiosamente, las EPOC-NPO exhibieron una mayor expresión de ACE2 y TMPRSS2 en comparación con las personas sin enfermedad, mientras que se observa un patrón contrastante en las EPOC-BO (Figs. 5a, b, 6 complementarias).

Se detectan relaciones significativas entre el aumento de la frecuencia de exacerbaciones de la EPOC y una mayor expresión génica para los cuatro factores del SARS-CoV-2 (Fig. 5e-h complementaria). Cuando se considera la función pulmonar, se observa una expresión significativamente mayor de TMPRSS2, furina y neuropilina-1 en la EPOC con la función pulmonar más pobre (<30 % FEV1 % teórico) y, solo la furina demostró una relación inversa significativa con el FEV1 % teórico (R = - 0.4880; p = 0.0072) (Fig. 5i-p complementaria).

Las mutaciones espontáneas en el genoma del SARS-CoV-2, adquiridas continuamente durante la pandemia, alteran la aptitud viral. Por lo tanto, seleccionamos tres aislamientos de pacientes para evaluar su patogenia diferencial: una cepa ancestral de Wuhan en Clade L (L-WU, ID de acceso de GISAID: EPI_ISL_407987), una cepa de Clade O (O-614D, ID de acceso de GISAID: EPI_ISL_574486) y una cepa Clade G (G-614G, ID de registro de GISAID: EPI_ISL_574489). Se identificaron cambios de aminoácidos en la proteína espiga-D614G, ORF1ab y se detectó un codón de terminación en NS6 entre G-614G y L-WU, mientras que se detectaron más mutaciones en ORF1ab, S, NS7a y N en O-614D (Suplementario Tabla 1). La infección por SARS-CoV-2 no indujo efectos citopáticos en NPO durante el período de infección de 96 h (Fig. 7 complementaria). La infectividad viral, evaluada por qPCR medida a las 48 y 72 h posteriores a la infección (hpi), no demostró diferencias significativas entre los tres aislamientos o entre las vías respiratorias superior e inferior (Fig. 8a-c complementaria). L-WU y G-614G se replicaron productivamente en NPO y BO, mientras que O-614D no pudo replicarse a pesar de la replicación productiva demostrable en células Vero-E6 (Fig. 4d, e, Figs. Complementarias 8d-f y 10). En las NPO, representativas de las vías respiratorias superiores y un sitio importante para la transmisibilidad del SARS-CoV-2, el G-614G se replicó a títulos significativamente más altos en comparación con L-WU a 96 hpi y se extendió a 168 hpi (Fig. 4d, Fig. 8g complementaria ). Además, los organoides infectados con G-614G provocan respuestas inmunitarias proinflamatorias mejoradas a las 72 hpi caracterizadas por una expresión mejorada del gen interferón-β (IFN-β), CXC motivo quimiocina ligando 10 (CXCL10) y factor de necrosis tumoral-α (ΤΝF-α) en NPO e interleucina-6 (IL-6) e IFN-β en BO, respectivamente (Fig. 4f, g). La infección con G-614G de NPO y BO aumenta significativamente CXCL10 a las 72 hpi (Figs. Complementarias 8h y 9).

Los datos clínicos y epidemiológicos proponen la EPOC como un factor de riesgo independiente para la COVID-1934 grave. Por lo tanto, a continuación evaluamos la infectividad, la replicación viral, las respuestas proinflamatorias y antivirales en los organoides de las vías respiratorias para dilucidar los correlatos celulares de estos hallazgos clínicos. Las investigaciones se basaron en la infección con las cepas L-WU y G-614G, pero no con la O-614D porque esta última no logró replicarse ni inducir respuestas inflamatorias en los modelos sin enfermedad. Se detectaron altos niveles de infectividad por SARS-CoV-2, comparables a los del estado sin enfermedad, en organoides de la EPOC de las vías respiratorias superior e inferior a las 48 y 72 hpi (Fig. 11 complementaria). Curiosamente, la cinética de replicación viral revela que L-WU se replicó de manera menos eficiente en NPO; sin embargo, se observó una replicación mejorada en los BO derivados de pacientes con EPOC (Fig. 5a, b). No se observaron diferencias para la variante G-614G entre la EPOC y las NPO no enfermas, aunque nuevamente fue evidente una replicación significativamente mejorada en las vías respiratorias inferiores (es decir, BO) en la primera (Fig. 5c, d). Es de destacar que los lisados ​​​​celulares (que detectan la expresión del gen de la nucleocápside (NS)) y los sobrenadantes de cultivo (que detectan virus infecciosos vivos) se usaron en los experimentos qPCR y TCID50, respectivamente, lo que representa las diferencias observadas entre la carga viral medida y los títulos virales. Sin embargo, en conjunto, esto sugiere una competencia de replicación mejorada general del G-614G y, de manera crítica, un potencial significativamente mayor y sólido para la replicación viral en los bronquios de la EPOC, el sitio predominante para el desarrollo de COVID-1934 grave (Fig. 5c, d ). La evaluación por qPCR de IL-6, IFN-β y CXCL10 no reveló diferencias entre los NPO y los BO después de la infección por L-WU con y sin EPOC. Sin embargo, la infección con G-614G demostró una reducción significativa de IL-6 e IFN-β en las vías respiratorias inferiores de la EPOC con una tendencia hacia la inhibición de CXCL10 en comparación con individuos no enfermos (Fig. 5e-h).

a–d Cinética de replicación viral de NPO y BO infectados con L-WU y G-614G a 1, 24, 48, 72 y 96 hpi mediante ensayo TCID50. Se ilustran n = 3 experimentos biológicamente independientes para infecciones por NPO y BO. Los datos se presentan como medios ± SEM y se realiza la prueba t no pareada. *P < 0,05; *** P < 0,001. [NPO L-WU: 24 hpi=0,0494; 72hpi=0,0004; BO L-WU: 24 hpi=0,0110; 96hpi=0,0152; BO G-614G: 24 hpi=0,0294; 96hpi=0,0457]. Análisis e-h qRT-PCR del ARN total extraído de NPO y BO infectados con L-WU y G-614G derivados de individuos no enfermos y pacientes con EPOC respectivamente a las 72 hpi para IL-6, IFN-β y CXCL10. Se ilustran n = 3 experimentos biológicamente independientes. Los datos se presentan como medios ± SEM y se realiza una prueba t no pareada. *P < 0,05. [Higo. 5h: IL-6 = 0,0237; IFN-β = ​​0,0248] Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El curso clínico de la EPOC está marcado por episodios de deterioro clínico denominados exacerbaciones. Las infecciones bacterianas representan una proporción de tales exacerbaciones, y aquí investigamos los resultados inflamatorios de Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus pneumoniae utilizando nuestras NPO "apical-out" de pacientes con EPOC (Fig. 6 y Fig. 11 complementaria). Los NPO no enfermos y con EPOC fueron comparablemente susceptibles a la infección por cualquiera de las bacterias, y los NPO con EPOC indujeron una mayor respuesta proinflamatoria a la infección bacteriana a niveles de ARN y proteína, lo que demuestra el valor de nuestro modelo de organoide de EPOC para evaluar la respuesta del huésped a la infección (Fig. 6b– d y Fig. 11 complementaria). El perfil transcriptómico masivo de las NPO con EPOC infectadas con P. aeruginosa demuestra un movimiento ciliar significativamente alterado y un aumento de las actividades de remodelación de la matriz extracelular y secretora en el estado no infectado en comparación con las NPO sin enfermedad. Como era de esperar, la infección por P. aeruginosa de NPO no enfermas desencadenó una inflamación aguda con producción y señalización elevadas de citoquinas (Fig. 6e, f). En particular, las respuestas inflamatorias y de estrés mejoraron significativamente en los NPO infectados con EPOC.

un diagrama esquemático que describe el método para la infección bacteriana de NPO. b Análisis qRT-PCR del ARN total extraído de NPO infectadas con P. aeruginosa derivadas de individuos no enfermos y pacientes con EPOC a las 6 hpi para el gen 16 S de P. aeruginosa. Se realizaron n = 4 y n = 6 experimentos biológicamente independientes para ND y EPOC, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± SEM. c Análisis qRT-PCR de NPO infectados con P. aeruginosa a las 6 hpi para el ligando 2 de quimiocinas con motivo C–C (CCL2), CCL5, ligando 10 de quimiocinas con motivo CXC (CXCL10), factor de necrosis tumoral-α (ΤΝF-α), interleucina -1β (IL-1β), IL-6 e IL-8. n = 4 para ND y n = 6 para EPOC. Los datos se presentan como medios ± SEM y se realiza una prueba t no pareada. *P < 0,05 [CCL2 = 0,0188; CXCL10 = 0,0239; IL-6 = 0,0470]. d CCL2, CCL4, CXCL10, TNF-β, interferón-γ (IFN-γ), IL-6, IL-8, IL-9, oncogén-α relacionado con el crecimiento (GRO-α) y factor estimulante de colonias de granulocitos ( G-CSF) tras la infección por P. aeruginosa en NPO a las 6 hpi mediante el ensayo Multiplex Luminex. n = 5 para ND y n = 6 para EPOC. Los datos se presentan como medios ± SEM y se realiza una prueba t no pareada. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; **** P < 0,0001. [CCL2: EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0039; ND-PAO1 frente a EPOC-PAO1 = 0,0062, CCL4: ND-MK frente a ND-PAO1 = 0,0190; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0040; CXCL10: ND-PAO1 = 0,0014; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0217; TNF-β: ND-MK frente a ND-PAO1 = 0,0333; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0096; IFN-γ: ND-MK frente a ND-PAO = 0,0114; ND-PAO1 frente a EPOC-PAO1 = 0,0002; IL-6: ND-PAO1 frente a EPOC-PAO1 = 0,0238; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0055; IL-8: EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0099; IL-9: COPD-MK frente a COPD-PAO1 < 0,0001; GRO-α: ND-MK frente a ND-PAO1 = 0,0062; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0018; G-CSF: ND-MK frente a ND-PAO1 = 0,0004; EPOC-MK frente a EPOC-PAO1 = 0,0005; ND = PAO1 vs EPOC-PAO1 = 0,0067]. e Análisis de componentes principales (PCA) de transcriptomas NPO de ND y EPOC que fueron tratados de forma simulada o infectados con Pseudomonas aeruginosa durante 6 h (n = 3 por grupo). f Mapa de calor de los genes expresados ​​​​diferencialmente (2561 genes) entre NPO infectados y no infectados por P. aeruginosa de ND y EPOC, respectivamente. Se identificaron cinco grupos de genes principales basados ​​en el perfil de expresión y se anotaron las funciones biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Aquí, demostramos el establecimiento y la caracterización de los organoides de la EPOC, derivados de células madre adultas para estudiar la interacción huésped-patógeno. Los organoides de la EPOC son estructuras esferoides tridimensionales multicelulares que exhiben características celulares esenciales de la EPOC. Los organoides de la EPOC demuestran hiperplasia de células caliciformes y reducción de la frecuencia de latidos ciliares, en relación con la gravedad de la enfermedad subyacente de sus respectivos donantes y, representativa de la patología esperada de la enfermedad. El análisis de una sola célula de los organoides de la EPOC reveló anomalías funcionales y del desarrollo representativas del estado de la enfermedad. La infección por SARS-CoV-2 de los organoides de la EPOC revela una replicación más productiva en los bronquios en comparación con los individuos sanos, lo que proporciona una base potencial para las observaciones clínicas de peores resultados de COVID-19 en la EPOC.

La remodelación de las vías respiratorias, en respuesta a la lesión e inflamación crónicas y recurrentes de las vías respiratorias, es una característica patológica importante de las enfermedades respiratorias crónicas, incluida la EPOC38,39,40. Además, la hipersecreción de moco y una gran abundancia de células caliciformes caracterizan las vías respiratorias de la EPOC, lo que promueve la obstrucción de las vías respiratorias, la alteración del aclaramiento mucociliar y las exacerbaciones41,42,43,44. Los organoides de la EPOC recapitulan este fenotipo de hiperplasia de células caliciformes y exhiben una mayor expresión del gen MUC5AC y una frecuencia de latido ciliar reducida en comparación con individuos sanos. Curiosamente, la expresión del gen MUC5AC en los organoides se asocia significativamente con la función pulmonar subyacente, la gravedad de la enfermedad y la frecuencia de exacerbaciones de un donante de EPOC, y fue evidente una relación inversa significativa entre la expresión del gen MUC5AC y la función pulmonar. Esta correlación negativa está en consonancia con un estudio multicéntrico reciente realizado en la cohorte EPOC SPIROMICS que demostró un aumento de las concentraciones de MUC5AC en el esputo en la EPOC en asociación con una función pulmonar más deficiente (FEV1 % previsto)45. Por lo tanto, MUC5AC se ha propuesto como un biomarcador potencial para pronosticar la EPOC.

Los transcriptomas unicelulares de organoides de la EPOC, en ausencia de exposición al humo del cigarrillo, estímulos inflamatorios, enzimas proteolíticas o modificación genética, revelan una alta coherencia con los modelos de EPOC in vitro e in vivo existentes a nivel fenotípico, transcriptómico y funcional46, 47, aunque con un tamaño de muestra pequeño. Estos análisis también revelan la hiperplasia de células caliciformes de la EPOC e ilustran una diferenciación celular puntuada en la EPOC debido al desarrollo celular inherentemente anormal que caracteriza su patogenia. Nuestro análisis de pseudotiempo es consistente con los estudios existentes que demuestran defectos en el desarrollo tisular, la regeneración y la diferenciación epitelial, incluidas las vías de señalización NOTCH, Wnt/β-catenina y Hedgehog observadas en las vías respiratorias de la EPOC48,49,50. Las vías biológicas asociadas con la EPOC, incluida la disfunción mitocondrial y la señalización de sirtuinas, fueron descubiertas por nuestra caracterización unicelular de los organoides de la EPOC, que ofrecen la ventaja significativa de evaluar poblaciones de células menores que no se reflejan en el RNAseq a granel51,52,53. La alteración de la estructura y función mitocondrial en el epitelio pulmonar influye en procesos clave que van desde la diferenciación celular, la muerte celular y la remodelación celular hasta las funciones de barrera física y la inmunidad innata, todos los cuales están relacionados con la patogénesis de la EPOC a través de la exposición al humo del cigarrillo54. La biogénesis mitocondrial desregulada junto con una mayor producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) puede causar una detención o senescencia irreversible del crecimiento celular, especialmente cuando se acompaña de un desequilibrio entre la capacidad oxidante-antioxidante, como se observa en la EPOC55,56. De acuerdo con nuestros hallazgos, esto es más evidente en las células club, células altamente sensibles al daño oxidativo en comparación con otros tipos de células epiteliales de las vías respiratorias57. Además, la sirtuina 1 (SIRT1) se ha implicado en el desarrollo y progresión de la EPOC y en la susceptibilidad a la infección viral58,59. Se observan niveles reducidos de SIRT1 en los pulmones con EPOC y se asocian con una mayor inflamación al aumentar la acetilación de RelA/p65 nuclear y la liberación de IL-859,60. Consistentemente, el aumento de la activación de los genes asociados con la respuesta inmune es detectable en las células basales, club y caliciformes de los organoides de la EPOC. Curiosamente, se identificaron distintos perfiles celulares en los BO de la EPOC, pero no en otros organoides donde las "células basales 2", "células club 2" y "células caliciformes 2" estaban sobrerrepresentadas. Se sugiere que el epitelio nasal actúe como representante de la región bronquial en la detección de genes asociados con la EPOC61,62; sin embargo, demostramos que nuestros modelos de organoides derivados de las vías respiratorias superiores e inferiores muestran perfiles de expresión génica asociados con la EPOC similares, pero diferentes perfiles celulares.

La evidencia actual sugiere que las personas con EPOC tienen un mayor riesgo de COVID-19 grave, incluida la hospitalización, el ingreso en la UCI, la necesidad de ventilación mecánica y la mortalidad27,28,63,64,65,66. En este estudio, nuestros modelos de organoides, independientemente de los antecedentes clínicos, demuestran la expresión de los factores de entrada clave del SARS-CoV-2 y sus proteasas endógenas relacionadas, incluidas ACE2, TMPRSS2, furina y neuropilina-167,68,69,70,71 ,72. La expresión de ACE2 y TMPRSS2 fue significativamente elevada en los organoides de la EPOC (NPO), hallazgos en línea con los informes existentes observados en las vías respiratorias de fumadores y pacientes con EPOC73,74,75,76. Usando tres clados de SARS-CoV-2 filogenéticamente distintos identificados en 2020, a saber, clado L, clado O y clado G, ilustramos que el aislado de clado G que contiene una mutación de pico D614G se replicó a títulos virales más altos y demostró respuestas proinflamatorias más sólidas77,78, incluso en puntos de tiempo prolongados, en comparación con las cepas de clado L y O que carecen de una mutación D614G. Esto está en línea con trabajos previos en modelos animales79,80,81,82 y de vías respiratorias humanas81,83. Críticamente, demostramos que los organoides de la EPOC eran más vulnerables a la infección por SARS-CoV-2, lo que resultó en una mayor replicación e inhibición en la expresión de IFN-β, específicamente en la región bronquial, luego de la infección con G-614G. Esta mayor capacidad de replicación, junto con una respuesta inmunitaria antiviral deteriorada después de la infección por G-614G, proporciona una perspectiva mecánica potencial para explicar en parte los peores resultados clínicos observados en pacientes con EPOC con COVID-19. Curiosamente, solo se demostró una replicación viral más eficiente en BO derivados de pacientes con EPOC, mientras que se observó un efecto contrastante en NPO en comparación con sus contrapartes no enfermas. Este interesante resultado posiblemente se deba a la sobrerrepresentación de las poblaciones celulares de "Células basales 2", "Células club 2" y "Células caliciformes 2" en BO de EPOC junto con la inhibición de IFN-β. De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio reciente ha demostrado que las células epiteliales bronquiales derivadas de pacientes con EPOC son más susceptibles a la infección por SARS-CoV-2 debido a su enriquecimiento para la expresión de correceptores, desequilibrios de proteasas y respuestas inflamatorias más fuertes84.

Los virus siguen siendo un desencadenante clave de las exacerbaciones de la EPOC85, y la inmunidad antiviral deficiente en la EPOC se asocia con un mayor riesgo de exacerbaciones inducidas por virus86,87. Se observa una expresión reducida de IFN en los bronquios con EPOC después de una infección por rinovirus y/o influenza, mientras que los pulmones resecados de una EPOC estable demuestran un deterioro constitutivo de IFN-β, IRF-7 y otros genes estimulados por interferón (ISG)88,89,90,91 . Los exacerbadores frecuentes de la EPOC, más marcados en aquellos con enfermedad grave, muestran un mayor agotamiento de los interferones tipo I y III y otros ISG en el esputo incluso durante la estabilidad clínica91,92,93. Es importante destacar que este trabajo aumenta aún más estas observaciones al ilustrar que el deterioro de la respuesta del interferón puede ser igualmente relevante después de la infección por SARS-CoV-2.

Las bacterias también tienen funciones importantes como agentes causantes de las exacerbaciones de la EPOC, donde Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa representan dos de las especies bacterianas más frecuentemente aisladas94,95,96. Las bacterias se aíslan del esputo de la EPOC en hasta el 50 % de las personas con enfermedad de moderada a grave durante la estabilidad, lo que aumenta a dos tercios de las personas en la exacerbación97,98. Las consecuencias inflamatorias de la presencia de bacterias en las vías respiratorias de la EPOC, incluidas las asociadas a las exacerbaciones agudas, se asocian con una peor función pulmonar y una hospitalización prolongada99,100. Los organoides de la EPOC (NPO), en particular los derivados de los exacerbadores frecuentes, revelan respuestas inflamatorias mejoradas tanto para S. pneumoniae como para P. aeruginosa a pesar de una permisibilidad comparable a la infección, lo que contribuye a los peores resultados clínicos observados en este grupo de pacientes. El uso de organoides de la EPOC potencialmente permite conocer la respuesta inflamatoria, a nivel individual, a organismos potencialmente patógenos y puede ser útil en la aplicación de enfoques de precisión para la evaluación de terapias antiinflamatorias o antimicrobianas en la EPOC.

Si bien establecemos y caracterizamos los organoides de la EPOC por primera vez, nuestro estudio tiene varias limitaciones. Se recogieron muestras nasofaríngeas y bronquiales para su uso como material de partida para generar modelos de organoides de diferentes donantes individuales en lugar de especímenes emparejados de un individuo. Las muestras humanas utilizadas para generar organoides no enfermos (sanos) procedían de donantes relativamente más jóvenes en comparación con las muestras de EPOC. Nuestro análisis de scRNA presentado se basó en una sola muestra de cada grupo respectivo y, por lo tanto, se justifica una mayor experimentación para validar estos hallazgos. Si bien nuestros organoides de la EPOC son fisiológicamente relevantes y representativos del epitelio de las vías respiratorias humanas, carecen de complejidad, como los sistemas inmunológico y vascular, un desafío continuo en el campo. Si bien hubiera sido interesante obtener datos de scRNA de organoides infectados con SARS-CoV-2, estos experimentos se excluyeron por motivos de seguridad y logística.

En resumen, establecemos y caracterizamos los organoides de la EPOC para estudiar la interacción huésped-patógeno que representa estructural y funcionalmente el estado de la enfermedad subyacente. Dichos modelos permiten la evaluación de la respuesta a la infección y/o al tratamiento farmacológico, a nivel individual, y pueden ser una adición útil en futuras estrategias de preparación para pandemias donde sean susceptibles de detección terapéutica de alto rendimiento y evaluación basada en la enfermedad de patógenos en evolución.

Se reclutaron veintiocho personas para el cultivo y la caracterización de NPO y BO, incluidos voluntarios sin EPOC (sanos) (n = 10) e individuos con EPOC (n = 18). Se obtuvieron hisopos nasofaríngeos flocados (FNPS) y/o muestras bronquiales, recolectadas a través de resección pulmonar y/o broncoscopia de fibra óptica como se describe a continuación, como material de partida para la experimentación.

Se reclutaron sujetos con espirometría normal y sin antecedentes de EPOC ni de ninguna otra enfermedad respiratoria. Todos los participantes no habían fumado durante toda su vida (excepto un único exfumador) y todos los participantes no tomaban ningún medicamento a largo plazo. Los datos demográficos de los participantes se resumen en la Tabla complementaria 2.

Se reclutaron pacientes de ⩾ 45 años con EPOC estable que asistían a clínicas ambulatorias respiratorias en centros de referencia terciarios para un seguimiento de rutina en tres hospitales en dos países de la siguiente manera: Hospital General de Singapur (Singapur), Hospital St Vincents (Sídney, Australia) y el John Hospital Hunter (Newcastle, Australia). La EPOC se definió según los criterios de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (GOLD)1,101. Se excluyeron los pacientes con antecedentes de asma (definida por síntomas variables y limitación del flujo de aire espiratorio según las pautas de la Iniciativa Global para el Asma; www.ginasthma.org) y aquellos que recibieron esteroides orales a largo plazo o cualquier agente inmunosupresor. La EPOC estable se definió como la ausencia de una exacerbación cuatro semanas antes del reclutamiento del estudio. Los no exacerbadores (NE) se definieron por la ausencia de cualquier exacerbación documentada en el año anterior al reclutamiento del estudio, mientras que los exacerbadores de la EPOC (E) y los exacerbadores frecuentes (FE) se definieron como tener menos o más de dos exacerbaciones, respectivamente, en el año. antes del reclutamiento del estudio. Una exacerbación de la EPOC se definió como un deterioro repentino de los síntomas respiratorios (tos, producción de esputo, dificultad para respirar y/o sibilancias) que requirieron terapia adicional (esteroides y/o antibióticos) según lo determinado por el médico respiratorio primario del paciente1. Para los exacerbadores frecuentes de la EPOC, se documentó un historial previo de exacerbaciones recurrentes a pesar de recibir terapia para la EPOC según las pautas GOLD1,101. Todos los pacientes reclutados estaban recibiendo el tratamiento apropiado para la EPOC (incluido el asesoramiento para dejar de fumar, la evaluación del inhalador, los planes de acción para la EPOC, los inhaladores como agonistas β de acción prolongada, antagonistas muscarínicos de acción prolongada, corticosteroides inhalados y/o broncodilatadores de acción corta, además de la vacunación como apropiado) basado en las pautas GOLD1,101. A todos los pacientes se les realizó una espirometría completa (para determinar el volumen espiratorio forzado en el 1er segundo por ciento predicho (FEV1 % predicho); FEV1 capacidad vital forzada; FVC y cociente FEV1/FVC) de acuerdo con los estándares técnicos definidos por los criterios ATS/ERS seguidos de muestreo nasofaríngeo y/o bronquial como se describe a continuación102. Los datos clínicos completos y la demografía de los participantes del estudio se detallan en la Tabla complementaria 2.

Este estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) de todos los hospitales e instituciones participantes y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Los números de referencia relacionados con las aprobaciones éticas en cada sitio fueron los siguientes: CIRB 2020/2338 (Singapur), IRB-2020-05-004 (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur), X02-0137 (Servicio de Salud del Área Sudoeste de Sydney, Australia) y H-163-1205 (Comité de ética LHD de Hunter New England, Australia). Para el aislamiento de los virus utilizados en este estudio, se recolectaron muestras de pacientes para cultivo según las pautas proporcionadas por PROTECT (2012/00917) como se describió anteriormente103, un estudio prospectivo multicéntrico para detectar nuevos patógenos y caracterizar infecciones emergentes, aprobado por el National Healthcare Group ( NHG) como parte de la preparación para pandemias para brotes de enfermedades nacionales en Singapur. El trabajo realizado en el laboratorio de Seguridad Biológica Animal de Nivel 3 (ABSL-3) de la Facultad de Medicina de Duke-NUS fue aprobado por el Comité de Bioseguridad ABSL3 de Duke-NUS, la Universidad Nacional de Singapur y el Ministerio de Salud de Singapur (BSL3/2007-03/ AD).

El muestreo nasofaríngeo se realizó de acuerdo con los protocolos establecidos por personal capacitado utilizando hisopos nasofaríngeos flocados (FNPS) con el kit estándar de transporte viral universal BBL. Brevemente, se insertó un FNPS en la fosa nasal a una profundidad adecuada y se giró varias veces antes de retirarlo104. Las muestras se transfirieron inmediatamente en hielo al laboratorio para su procesamiento. Los HNPEC se liberaron de los hisopos al lavarlos con medio de transporte al menos 20 veces. A continuación, las células se sembraron en placas de 6 pocillos recubiertas previamente con colágeno IV humano y se cultivaron en medio de expansión B/D (Tabla complementaria 3) complementado con 5 μM de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil] -S-fenilglicina t-butil éster (DAPT) para crecer como monocapas. El medio se refrescó cada 48 h hasta alcanzar la confluencia.

El muestreo bronquial se realizó en pacientes sometidos a resección pulmonar, trasplante y/o broncoscopia de fibra óptica de acuerdo con las indicaciones clínicas y según las pautas estándar como se describió anteriormente105,106. Se diseccionó el tejido pulmonar obtenido en la toracotomía y se aislaron las vías respiratorias. A continuación, se eliminó el epitelio de la capa estromal mediante macrodisección. En las muestras obtenidas mediante broncoscopia, los HBEC se obtuvieron utilizando un cepillo de citología de nailon con funda única aplicado bajo visión directa. Se tomaron aproximadamente 4-8 cepillados de bronquios de segunda a tercera generación, y las células se lavaron de los cepillos con DMEM. A continuación, las células se sembraron en placas en matraces de cultivo de tejidos en medio de crecimiento epitelial bronquial (BEGM) con suplementos de crecimiento y el medio se refrescó cada 48 h hasta que se alcanzó la confluencia.

Después de que HNPEC y HBEC alcanzaran la confluencia como monocapas, se sembraron 2 × 105 células en la cámara apical de un Transwell de 24 pocillos, recubiertos previamente con 30 µg/ml de PureCol. El transwell que contenía los HNPEC o HBEC se cultivó primero en fase sumergida y, una vez que la capa celular estaba completamente intacta, se retiró el medio de la cámara apical y las células se cultivaron posteriormente en un ALI a partir de entonces. El medio se actualizó dos veces por semana y las células se diferenciaron durante 18 días usando el medio de diferenciación ALI (ALI-Diff) (Tabla complementaria 4) y posteriormente se diferenciaron en organoides de las vías respiratorias.

Los ALI-HNPEC o ALI-HBEC diferenciados durante 18 días se separaron de transwells con TrypLE, se resuspendieron en matrigel y se cultivaron en medio Airway Organoid (AO) (Tabla complementaria 5) suplementado con medio acondicionado con R-spondin-1 al 25 %, 25 ng/ ml de FGF7 y 100 ng/ml de FGF10 para expansión. Las células se expandieron y formaron estructuras esferoides en matrigel. En el día 5 de expansión, los esferoides se pasaron a la cámara apical de un inserto de 12 pocillos para su diferenciación en ALI durante 4-6 semanas adicionales. El medio se actualizó dos veces por semana usando medio AO con 5 ng/ml de FGF7 y 20 ng/ml de FGF10 durante 4 a 6 semanas hasta que los organoides se diferenciaron bien.

Las metodologías para la generación de organoides apicales han sido reportadas previamente por otros 107,108. En resumen, se recogieron NPO y BO de insertos de 12 pocillos y se lavaron dos veces con DMEM/F12 avanzado (ad) con 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (P/S). Los NPO y BO lavados se incubaron con EDTA 5 mM en PBS durante 1 h a 4 ° C con rotación para solubilizar el matrigel restante. Los NPO y BO se centrifugaron a 200x g durante 5 min a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en medio suplementado con 5 ng/ml de FGF7 y 20 ng/ml de FGF10 y se cultivó en suspensión utilizando placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos de unión ultrabaja. Los NPO y BO suspendidos se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 3 días antes de los estudios de infección.

En este estudio se utilizaron tres cepas de SARS-CoV-2, incluida (1) una cepa ancestral de Wuhan del clado L, hCoV-19/Singapore/2/2020 (L-WU) (ID de acceso de GISAID: EPI_ISL_407987); (2) una cepa del clado O aislada a mediados de 2020, hCoV-19/Singapore/1003/2020 (O-614D) (ID de acceso de GISAID: EPI_ISL_574486) y (3) una variante D614G del clado G, hCoV-19/ Singapur/1005/2020 (G-614G) (ID de registro de GISAID: EPI_ISL_574489). La comparación de secuencias de las tres cepas se muestra en la Tabla complementaria 1. El virus se propagó en células Vero-E6 cultivadas con DMEM suplementado con 5 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de P/S a 37 °C, 5 % de CO2. Los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron, centrifugaron y dividieron en alícuotas una vez que se observó el efecto citopático (CPE). Los títulos virales se determinaron por dilución limitada utilizando el método de Karber109.

Se infectaron células Vero-E6 para determinar la dosis infectiva del cultivo de tejido (TCID50/ml). Se utilizaron células Vero-E6 en placas de 96 pocillos para ensayos de titulación. Las muestras se diluyeron en serie en DMEM, suplementadas con FBS al 5 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células se infectaron con 100 µl de muestra diluida por cuadruplicado. Las células se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 4 días. Después de la incubación, se registraron los pocillos con CPE y se determinó el título de virus libre de células (TCID50/mL) para cada muestra mediante dilución limitada usando el método Karber109.

Las células Vero-E6 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se infectaron con SARS-CoV-2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 para determinar la cinética de replicación viral de las tres cepas. Los sobrenadantes se recolectaron a las 24, 48, 72 y 96 hpi y se determinaron los títulos virales.

Los NPO y los BO con salida apical se lavaron una vez con adDMEM/F12 con P/S al 1 % antes de la infección y se resuspendieron en 1 ml de medio AO. Se tomaron 50 µl de organoide y se disociaron con TrypLE express para el conteo de células y, para determinar el número total de células y el volumen de virus a utilizar para MOI = 0,1. Los NPO y BO con salida apical se infectaron con SARS-CoV-2 en suspensión en placas de fijación ultrabaja durante 1 h a 37 °C, 5 % de CO2. Después de 1 h de incubación, los NPO y BO infectados se lavaron con adDMEM/F12 y P/S al 1 % tres veces. Los organoides se volvieron a incrustar en Matrigel al 75 % y se sembraron a razón de 30 µl por gotita de organoide en una placa de cultivo de 24 pocillos. Se añadieron 500 µl de medio AO a cada pocillo respectivo después de solidificar el Matrigel. A continuación, los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron a las 1, 24, 48, 72 y 96 hpi para el ensayo TCID50 y los ensayos Luminex. Los lisados ​​​​celulares se recolectaron en tampón RLT con β-mercaptoetanol a 48 y 72 hpi para análisis de reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) como se describe a continuación.

La cepa PAO1110 de Pseudomonas aeruginosa se cultivó en caldo de soja tríptico (TSB) con agitación a 37 °C, durante la noche. La cepa de Streptococcus pneumoniae INS-E611 (serotipo 6B)111 se cultivó durante la noche en caldo Todd Hewitt (THB) a 37 °C y 5 % de CO2. Los cultivos bacterianos durante la noche se centrifugaron y lavaron con PBS antes de la determinación de la concentración bacteriana mediante la medición de OD600nm. Pseudomonas aeruginosa se diluyó a una concentración de 5 × 106 CFU/ml y Streptococcus pneumoniae se diluyó a una concentración de 7,5 × 106 CFU/ml en medio AO sin antibióticos antes de la infección. Después de la determinación del número de células, las NPO apicales se infectaron en suspensión durante 1 h a 37 °C, 5 % de CO2. Después de 1 h de incubación, las NPO infectadas se lavaron tres veces con adDMEM/F12 y P/S al 1 %. Luego, los NPO se volvieron a incrustar en Matrigel al 75 % y se sembraron a razón de 30 µl por gotita de organoide en una placa de cultivo de 24 pocillos. Se añadieron 500 µl de medio AO (sin antibióticos) con 300 µg/ml de gentamicina a cada pocillo respectivo después de solidificar el Matrigel. Los lisados ​​​​celulares se recolectaron en tampón RLT con β-mercaptoetanol a las 6 hpi para los análisis de qPCR. Los sobrenadantes de cultivos celulares se recogieron a las 6 hpi para la detección de citocinas y quimiocinas secretoras utilizando ensayos Luminex.

Los organoides de las vías respiratorias (AO) cultivados en matrigel o suspensión se tomaron imágenes y/o grabaron en video utilizando un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-U Nikon dentro de la instalación ABSL3 con los aumentos indicados.

Los organoides intactos se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de lavado con PBS y permeabilizados con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 30 min. A esto le siguió el bloqueo con tampón de tinción (BSA al 1 %, Triton X-100 al 0,2 % en PBS) durante 1 h. A continuación, los organoides se incubaron con anticuerpos primarios que incluían anti-ACE2, anti-tubulina acetilada, anti-MUC5AC, anti-TP63 y anti-SCGB1A1 diluidos en tampón de tinción durante 3 h a temperatura ambiente, seguido de lavado tres veces con PBS. Los anticuerpos secundarios marcados con AlexaFluor 488, 594 o 647, faloidina y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se incubaron con organoides durante 1 hora a temperatura ambiente. Los organoides se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje antidecoloración ProLong™ Glass y se cubrieron con cubreobjetos de vidrio. Las imágenes se capturaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 800 y se procesaron con el software de análisis de imágenes ZEN (Zeiss). La información sobre los anticuerpos utilizados en este estudio se enumera en la Tabla complementaria 7 y se verificaron todos los anticuerpos primarios utilizados en este estudio ((Figuras complementarias 13, 14).

El ARN total de NPO y BO con o sin infección, respectivamente, se extrajo utilizando el RNeasy Plus Mini Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se realizó la transcripción inversa utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT para generar ADNc en las siguientes condiciones: 37 °C durante 15 minutos, 85 °C durante 5 segundos, seguido de incubación a 4 °C. El ADNc se diluyó y amplificó utilizando la mezcla maestra GoTaq® qPCR SYBR green en las siguientes condiciones: 95 °C durante 2 minutos, seguido de 95 °C durante 3 segundos y 60 °C durante 30 segundos para un total de 40 ciclos. El gen N del SARS-CoV-2 se amplificó utilizando la mezcla maestra GoTaq® Probe qPCR Master Mix en las mismas condiciones. Las secuencias de cebadores y sondas utilizadas en este estudio se resumen en la Tabla complementaria 6. La amplificación de qPCR que involucraba muestras infectadas con SARS-CoV-2 se realizó en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad) dentro de la instalación ABSL3, mientras que no -El trabajo relacionado con el SARS-CoV-2 se realizó en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex (Thermofisher Scientific). Se realizó la cuantificación absoluta de los siguientes genes: TP63, SCGB1A1, FOXJ1, MUC5AC, ACE2, TMPRSS2, Furin, Neuropilin-1 y el gen N del SARS-CoV-2 utilizando curvas estándar generadas con ADN plasmídico. Se determinaron las cantidades relativas de ARNm de P. aeruginosa 16 S, S. pneumoniae lytA, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-β, TNF-α, CCL2, CCL5 y CXCL10 (normalizado con β-actina) utilizando el método 2−ΔΔCt112.

Los sobrenadantes de cultivos celulares de NPO y BO infectados con SARS-CoV-2 a las 48 y 72 hpi y NPO infectados con P. aeruginosa y S. pneumoniae a las 6 hpi se sometieron a un ensayo de citoquinas multiplexado utilizando un panel de detección de citoquinas Bio-Plex Pro Human ( Biorad) que contiene 48 citocinas humanas según las instrucciones del fabricante. Las intensidades espectrales se cuantificaron en una máquina MagPix (Luminex Corporation) y un sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad) para estudios de SARS-CoV-2 e infección bacteriana, respectivamente. Las concentraciones de citocinas se calcularon interpolando a partir de curvas estándar a través del ajuste de curvas 5PL.

La tecnología µOCT ha sido descrita previamente113,114,115,116. En resumen, el sistema µOCT incluía una consola de imágenes OCT de dominio espectral (SD-OCT) y una sonda de sobremesa. Una fuente de luz supercontinua iluminó un divisor de haz 50/50. La mitad de la fuente de luz se transmitió a la sonda de sobremesa y la luz devuelta por la sonda se transmitió a un espectrómetro. El espectrómetro estaba compuesto por una rejilla de transmisión holográfica de fase de volumen de 960 líneas/mm, una lente de cámara multielemento y una cámara de exploración lineal. La luz reflejada desde el brazo de referencia y la que se dispersa desde el brazo de muestra se combinaron con el divisor de haz de vuelta a la consola. El escaneo transversal (x, y) se realizó utilizando un par de escáneres de galvanómetro controlados por una placa de salida analógica. La salida de la cámara se transfirió a una placa de adquisición de imágenes.

Las imágenes µOCT se realizaron en BO humanos con iluminación incidente en la vista superior de los organoides. El eje de la óptica de imágenes se coloca típicamente dentro de los 10° de la normal al plano de la celda para minimizar los errores en las mediciones geométricas. La frecuencia de latido ciliar (CBF) se determina utilizando una serie temporal de imágenes y se evalúa cuantificando la frecuencia de la amplitud máxima en las regiones de la imagen que exhiben un comportamiento oscilatorio. En promedio, se evalúan de 6 a 10 organoides por donante en hasta 10 regiones de actividad ciliar por secuencia de imágenes para determinar el CBF. Todo el análisis de imágenes se realizó utilizando ImageJ y MATLAB.

La secuenciación de ARN de una sola célula se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de Chromium Next GEM Single Cell 3 'GEM Library & Gel Bead Kit V3.1 según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los NPO y los BO se lavaron una vez con adDMEM/F12 para eliminar el matrigel y luego se incubaron con TrypLE express durante 10 min. A continuación, se consiguieron suspensiones unicelulares pasando repetidamente a través de las grandes estructuras no disociadas con una punta P1000. Las células individuales se centrifugaron y se resuspendieron en medio AO para el recuento de células para obtener una densidad de 1000 células/µl. Las células se cargaron en el chip Chromium Next GEM G y se ejecutaron en el controlador Chromium. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon siguiendo el protocolo estándar del fabricante. Las bibliotecas de ADN se secuenciaron en pares y se indexaron individualmente en una plataforma Illumina HiSeq2500 v2 (28x91bp) en la instalación de secuenciación ubicada en el Centro de Ingeniería de Ciencias de la Vida Ambiental de Singapur (SCELSE), Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.

Las lecturas fastq sin procesar de NPO y BO de pacientes no enfermos y EPOC se alinearon con el genoma de referencia GRCh38 humano utilizando Cell Ranger 6.0.2. A continuación, las matrices de recuento de células individuales se analizaron con Seurat 4.0117. Se excluyeron las células con <200 genes detectados y >20 % de genes mitocondriales. Luego, los conjuntos de datos filtrados se normalizaron utilizando la función SCTransform en Seurat y se integraron para generar una matriz de datos unificados para el análisis comparativo posterior entre personas sin enfermedad (agrupación de una línea NPO-ND y una línea BO-ND) y EPOC (agrupación de una línea NPO-ND). -línea EPOC y una línea BO-EPOC).

La agrupación de células se realizó con el parámetro de resolución establecido en 0,3. Se utilizó la reducción dimensional no lineal para construir las gráficas UMAP unificadas y específicas del estado de la enfermedad, como se ilustra. El análisis de expresión diferencial se realizó en función de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon no paramétrica con las funciones Seurat FindAllMarkers y FindMarkers, respectivamente, para identificar marcadores genéticos de cada grupo de células y genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) entre las células no enfermas y EPOC. El análisis de enriquecimiento funcional se realizó utilizando Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) y GSEA118. Para validar nuestros modelos de organoides de la EPOC, comparamos las principales funciones enriquecidas, basadas en DEG, de conjuntos de datos de RNAseq a granel publicados públicamente de células epiteliales de las vías respiratorias cultivadas y/o biopsias clínicas de la EPOC con los de nuestros conjuntos de datos de scRNA-seq119. Se identificaron y asignaron tres conjuntos de datos relevantes (números de acceso: GSE124180, GSE146532 y GSE162154) con Rsubread 3.6.2 al gen Ensembl ID120, sin embargo, GSE124180 y GSE146532 tuvieron que ser excluidos porque sus conjuntos de muestras no enfermas y con EPOC no formaban grupos distintos. unos de otros basados ​​en el análisis de componentes principales (PCA). En consecuencia, solo se utilizó GSE162154 para nuestro análisis comparativo. Los conjuntos de datos de RNAseq a granel se descargaron de Gene Expression Omnibus (GEO).

La anotación del tipo de célula se analizó primero utilizando las bases de datos Blueprint, ENCODE y Human Primary Cell Atlas utilizando celldex (1.2.0), lo que confirmó que todas las células exhibían un fenotipo epitelial121. Para determinar el tipo de célula de cada grupo respectivo, se usó GSEA para hacer comparaciones con los conjuntos de genes característicos de las células de las vías respiratorias y los pulmones, respectivamente, de García et al. (2019)36 y Travaglini et al. (2020)37 respectivamente. El análisis de pseudotiempo se realizó utilizando Monocle3122 y la trayectoria celular se infirió con las células basales cíclicas especificadas como el nodo raíz (origen de la trayectoria; pseudotiempo = 0).

Los NPO no enfermos y con EPOC se trataron de forma simulada o se infectaron con Pseudomonas aeruginosa (PAO1) durante 6 h. A continuación, los organoides se lisaron con tampón Qiagen RLT plus y se aisló el ARN con el mini kit Qiagen RNeasy Plus. Se prepararon bibliotecas de ARNm de cadena para cada muestra con purificación de oligo dT utilizando el kit Illumina TruSeq Stranded mRNA. Las bibliotecas se secuenciaron en pares de 100 pb (PE100) utilizando el sistema Illumina HiSeq2500.

Datos sin procesar de secuenciación de extremos pareados en formato FASTQ (disponible en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) de NCBI: GSE201465 se recortó para secuencia de adaptador/secuencia de baja calidad usando trimmomatic-0.39 (parámetro: /trimmomatic-0.39/adapters/TruSeq3-PE- 2.fa:2:30:10:1:TRUE LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:30). La calidad de las lecturas de secuencia después del recorte se verificó mediante FastQC v0.11.8. Las lecturas de secuencia recortadas se mapearon a el genoma de referencia humano GRCh38.p13 (hg38) mediante la función de alineación disponible en Rsubread v2.6.4, que se ejecutó en el software R v4.1.0 (parámetro: Type=rna). La extracción del recuento de características se realizó mediante la función featureCounts disponible en Rsubread v2 .6.4, que luego se ejecutó en el software R v4.1.0 (parámetros: annot.ext=hg38.ensGene.gtf, isGTFAnnotationFile=TRUE, isPairedEnd=TRUE).

La expresión génica diferencial se realizó utilizando DESeq2 (v1.34.0)123. Los genes se consideraron expresados ​​diferencialmente cuando log2 Fold Change >± 1 y el valor de p ajustado fue <0,05. Todos los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) entre los NPO no enfermos y con EPOC tratados de forma simulada e infectados con P. aeruginosa se sometieron a una agrupación jerárquica basada en su tendencia de expresión para formar 5 grupos de genes principales. Los términos de ontología de genes enriquecidos de cada grupo de genes se analizaron utilizando ViSEAGO124.

Para los experimentos no relacionados con la infección descritos en las Figs. 1–3, n = 7; n = 10; Se usaron n = 3 y n = 8 réplicas biológicamente independientes para NPO-no enfermo (ND); NPO-EPOC; BO-ND y BO-EPOC, respectivamente. Para los estudios de infección descritos en las Figs. 4–6, se realizaron al menos n = 3 réplicas biológicamente independientes. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 8.3.0). Se probó la normalidad de los datos continuos usando la prueba de Kolmogorov-Smirnoff (prueba KS). Los datos se presentan como media con error estándar para datos distribuidos normalmente, y se usa una prueba t de Student o análisis de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias entre grupos, según corresponda. Para las variables no normales, las medianas se presentan con el rango intercuartílico y se realizan la prueba de rango con signo de Wilcoxon (datos apareados) y la prueba U de Mann-Whitney (datos no apareados) al comparar dos grupos y/o la prueba de Kruskal-Wallis para > 2 grupos , respectivamente. Se realizaron análisis del coeficiente de correlación de Spearman (no paramétrico) para evaluar las correlaciones entre los niveles de expresión de genes específicos y el volumen espiratorio forzado en el 1.er segundo porcentaje previsto (FEV1% previsto). Un valor de p <0,05 se consideró significativo y el grado de significación se ilustró de la siguiente manera: *P <0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 y ****P < 0,0001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Secuenciación de ARN de una sola célula: las lecturas fastq sin procesar de NPO y BO de pacientes no enfermos y con EPOC se alinearon con el GRCh38 humano. genoma de referencia p13 (hg38). Se utilizaron tres conjuntos de datos de RNAseq a granel publicados y disponibles públicamente ((Números de acceso: GSE124180, GSE146532 y GSE162154) de células epiteliales de las vías respiratorias cultivadas y/o biopsias clínicas de la EPOC para compararlos con nuestro conjunto de datos de scRNA. Los datos de secuenciación de ARN unicelular 10x generados en este estudio ha sido depositado en la base de datos GEO bajo el código de acceso GSE186017.

Secuenciación de ARN a granel: las lecturas FASTQ sin procesar se asignaron al genoma de referencia humano GRCh38.p13 (hg38). Los datos de secuenciación de ARN a granel generados en este estudio se depositaron en la base de datos GEO con el código de acceso GSE201465.

Todos los demás datos relevantes que respaldan los hallazgos clave de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria. Los datos de origen se proporcionan en este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts R para el análisis de RNA-seq de una sola célula están disponibles en https://github.com/chenghongsheng/SC_RNAseq-airway-organoid y https://doi.org/10.5281/zenodo.7290276.

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Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur bajo su Fondo de Investigación COVID-19 administrado por el Consejo Nacional de Investigación Médica del Ministerio de Salud de Singapur (MOH-000409) (a SHC) y el Consejo Nacional de Investigación Médica COVID19RF2-0006 (a LF.W y DEA) y por el Consejo Nacional de Investigación Médica del Ministerio de Salud de Singapur bajo su Premio al Científico Clínico (CSA) (MOH-000710) (SHC). LLYC cuenta con el apoyo de la Escuela de Medicina Lee Kong Chian, Universidad Tecnológica de Nanyang bajo la Beca Postdoctoral del Decano y la Beca Wong Peng Onn (002823-00001). Agradecemos al Sr. Ter Soo Kai de la Escuela de Medicina Lee Kong Chian de la Universidad Tecnológica de Nanyang por su ayuda con los cultivos de células Vero-E6. Agradecemos al Sr. Mervyn Ong del Hospital General de Singapur por su ayuda en la coordinación de la recolección y el transporte de hisopos nasofaríngeos. Agradecemos al Dr. Viji Vijayan y al Sr. Benson Ng de las instalaciones ABSL3 de la Escuela de Medicina Duke-NUS por la gestión y asistencia logística. Los autores desean agradecer al Centro TARIPH de Excelencia en Investigación Respiratoria por su apoyo de colaboración. Las ilustraciones esquemáticas en las Figs. 1a, 4a, b y 6a se crearon con BioRender.com.

Estos autores contribuyeron igualmente: Lin-Fa Wang, Sanjay H. Chotirmall.

Escuela de Medicina Lee Kong Chian, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Louisa LY Chan, Hong Sheng Cheng, Francis Xavier Ivan, Pei Yee Tiew, Tsin Wen Yeo, Nguan Soon Tan y Sanjay H. Chotirmall

Programa de Enfermedades Infecciosas Emergentes, Escuela de Medicina Duke-NUS, Singapur, Singapur

Danielle E. Anderson, Adrian EZ Kang, Randy Foo, Akshamal M. Gamage y Lin-Fa Wang

Escuela de Ingeniería Eléctrica y Electrónica, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Si Chen y Linbo Liu

Departamento de Medicina Respiratoria y de Cuidados Críticos, Hospital General de Singapur, Singapur, Singapur

Pei Yee Tiew, Mariko Siyue Koh y Ken Cheah Hooi Lee

Escuela de Medicina Duke-NUS, Singapur, Singapur

Pei Yee Tiew, Mariko Siyue Koh y Ken Cheah Hooi Lee

Centro de Investigación Prioritaria para Pulmones Saludables, Instituto de Investigación Médica Hunter y Escuela de Medicina y Salud Pública, Universidad de Newcastle, Newcastle, NSW, Australia

Kristy Nichol, Prabuddha S. Pathinayake y Peter AB Wark

Escuela de Ciencias de la Vida, Facultad de Ciencias, Universidad de Tecnología de Sydney, Sydney, NSW, Australia

Yik Lung Chan y Brian G. Oliver

Centro Nacional de Enfermedades Infecciosas, Singapur, Singapur

Tsin Wen Yeo

Instituto Woolcock de Investigación Médica, Universidad de Sydney, Sydney, NSW, Australia

Brian G.Oliver

Departamento de Medicina Respiratoria y del Sueño, John Hunter Hospital, New Lambton Heights, NSW, Australia

Pedro AB Wark

Escuela de Ingeniería Química y Biomédica, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Linbo Liu

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, Singapur

Nguan pronto bronceado

Singhealth Duke-NUS Global Health Institute, Singapur, Singapur

Lin Fa Wang

Departamento de Medicina Respiratoria y de Cuidados Intensivos, Hospital Tan Tock Seng, Singapur, Singapur

Sanjay H. Chotirmall

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LLYC, LFW. y SHC conceptualizó el estudio; LLYC estableció los organoides de las vías respiratorias humanas, realizó experimentos de infecciones virales y bacterianas, imágenes confocales y análisis de datos; DEA, AEZK, RF y AMG realizaron experimentos de infección viral y análisis de datos; LLYC y HSC realizaron la preparación de la biblioteca de células individuales; HSC, FXI y NST realizaron análisis transcriptómicos de ARN a granel y de células individuales; SC y LL realizaron las imágenes y el análisis de μOCT; TPY, MSK, KCH L y YTW ​​recolectaron muestras clínicas; BGO y PABW proporcionaron las muestras bronquiales. KN y PSP cultivaron las células epiteliales bronquiales humanas; YLC realizó inmunotinción para la verificación de anticuerpos; LLYC y SHC escribieron el manuscrito; todos los autores contribuyeron a la edición del manuscrito.

Correspondencia a Louisa LY Chan o Sanjay H. Chotirmall.

SHC forma parte de los consejos asesores de CSL Behring, Pneumagen Ltd y Boehringer Ingelheim, ha recibido honorarios por conferencias de Astra-Zeneca y forma parte de los Consejos de supervisión de datos y seguridad (DSMB) de Inovio Pharmaceuticals y la Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal, todo ello fuera del trabajo presentado. . Todos los demás autores no tienen conflictos que revelar.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Chan, LLY, Anderson, DE, Cheng, HS et al. El establecimiento de organoides de la EPOC para estudiar la interacción huésped-patógeno revela una mayor aptitud viral del SARS-CoV-2 en los bronquios. Nat Comun 13, 7635 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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Recibido: 25 de octubre de 2021

Aceptado: 22 de noviembre de 2022

Publicado: 10 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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