El ARN mensajero en nanopartículas lipídicas rescata las células HEK 293 de los lípidos

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22293 (2022) Citar este artículo

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Las herramientas analíticas para estudiar la fisiología celular son fundamentales para optimizar las interacciones entre el fármaco y el huésped. La espectroscopia de RMN de persecución de pulso en tiempo real, RTPC-NMR, se introdujo para monitorear la cinética de la producción de metabolitos en células HEK 293T tratadas con nanopartículas lipídicas similares a la vacuna COVID-19, LNP, con y sin ARNm. Los parámetros de flujo cinético se resolvieron para la incorporación de la marca isotópica en los metabolitos y la eliminación de los metabolitos marcados de las células. Los cambios en los tiempos característicos de producción de alanina implicaron una disfunción mitocondrial como consecuencia del tratamiento de las células con nanopartículas lipídicas, LNP. La disfunción mitocondrial se redujo en gran medida mediante la inclusión de ARNm en las LNP, cuya presencia aumentó el tamaño y la uniformidad de las LNP. La metodología es aplicable a todas las células cultivadas.

El notable éxito de las vacunas contra la COVID-19 basadas en nanopartículas lipídicas de ARNm modificadas con pseudouridina, LNP, que aprovecha la maquinaria de traducción innata impulsada por el metabolismo celular, impulsa esta tecnología a la vanguardia de la medicina1,2,3,4,5,6 . Se han probado muchas aplicaciones potenciales de los LNP de ARNm para tratar enfermedades crónicas como la diabetes7,8,9, el cáncer y los trastornos genéticos10,11. Las terapias basadas en el ARN mensajero utilizan un conjunto complejo de moléculas biológicas que deben optimizarse para cada aplicación. ¿Pueden estas células competir con las células circundantes por los escasos recursos de nutrientes en los tejidos vivos? ¿Cuánto durará la producción efectiva de productos génicos de ARNm? ¿La degradación de los LNP de ARNm, que libera metil pseudouridina, inhibirá la transcripción? ¿Los lípidos que constituyen los LNP dañarán el plasma y las membranas celulares internas? Estos problemas son críticos y deben abordarse para facilitar la implementación terapéutica.

La respuesta dinámica de las células a los tratamientos farmacológicos se puede evaluar mediante el perfil metabólico, que generalmente se logra mediante el uso de espectroscopia de masas o espectroscopia de RMN12,13. La metodología normalmente requiere la lisis celular y la extracción para detectar las concentraciones totales de metabolitos, proporcionando instantáneas de la fisiología celular durante un período de horas a días que está intrínsecamente sesgado debido a los procesos de varios pasos necesarios para preparar las muestras12,13. La metodología invasiva interrumpe la estructura compartimental de las redes metabólicas y es posible que no refleje los procesos reactivos que tienen lugar después de la administración de la vacuna basada en LNP. La espectroscopia de RMN en tiempo real utiliza la abundancia natural de 13C o análisis basados ​​en trazadores para identificar metabolitos mediante la recopilación de espectros de 1H editados con isótopos de 13C de las células, lo que permite una rápida adquisición de datos, lo que aumenta la resolución temporal de los experimentos a 10 minutos o menos14,15.

Los estudios metabolómicos basados ​​en RMN en tiempo real más recientes utilizan un biorreactor para mantener las células en un estado fisiológicamente activo y pueden detectar metabolitos intracelulares libres, pero carecen de la capacidad de monitorear reacciones clave como la glucólisis que tiene lugar en el transcurso de minutos16,17,18 . La introducción de la espectroscopia de RMN de persecución de pulsos en tiempo real, RTPC-NMR, combina el uso de 13C-glucosa y RMN de protones editada con 13C con una criosonda de RMN ultrasensible19 y el diseño mejorado de un biorreactor20 para aumentar la resolución temporal de los experimentos a 47 s permitiendo seguir cambios rápidos en los flujos metabólicos en respuesta a los estímulos. Los metabolitos marcados con 13C se observan contra un fondo no marcado. Este método representa la tecnología más avanzada para analizar la salud celular al capturar la dinámica de la incorporación de carbono 13C de manera imparcial para revelar cómo los estímulos afectan las vías metabólicas.

Se preparó ARNm de luciferasa modificado que contenía N1-metilpseudouridina en lugar de uridina mediante transcripción in vitro basada en un protocolo publicado previamente21,22 y se usó para todos los experimentos. La incorporación de N1-metilpseudouridina aumenta la estabilidad del ARNm y mejora la expresión de proteínas en células de mamíferos22,23. La transcripción purificada incluía una cola poli(A) 3' de ~ 150 nucleótidos y Cap124 5' para facilitar aún más la traducción de proteínas (Figura 1 complementaria). El ARNm modificado se transfectó en células HEK 293T durante 24 h utilizando cinco reactivos de transfección (Fig. 1a, Tabla complementaria 1). Las células HEK 293T se utilizaron previamente para controlar la captación y la expresión del ARNm de luciferasa21,22. De acuerdo con Kariko et al.21,22, solo un reactivo, Lipofectamine 2000, LF, entregó suficiente ARNm en las células para generar una señal de luminiscencia dependiente de luciferasa.

La lipofectamina aumenta la estabilidad del ARNm transfectado en células HEK 293T. (a). Las células se transfectaron con ARNm de luciferasa modificado durante 24 h utilizando cinco reactivos diferentes y se cuantificó la actividad de luminiscencia de luciferasa resultante. El control no contenía ARNm ni reactivo de transfección para evaluar la luminiscencia inicial. Las barras indican error relativo. (b). Luminiscencia resultante de la transfección VECT con ARNm de luciferasa modificado desnudo (cuadrados) y transfección mediada por LF con ARNm de luciferasa modificado (círculos). (C). Luminiscencia de células HEK 293T tratadas con LF-mRNA durante diferentes tiempos. Las muestras se trataron de forma continua (línea continua, círculos) o durante 8 h (línea de puntos, cuadrados) o 12 h (línea discontinua, triángulos).

Se utilizó la técnica de intercambio de volumen para transferencia convectiva, VECT25,26 para transfectar células HEK 293T con ARNm desnudo. A pesar de la base modificada químicamente, la producción de proteínas fue limitada y la señal dependiente de luciferasa disminuyó rápidamente (Fig. 1b, Tabla complementaria 2). La transfección mediada por LF del mismo ARNm dio como resultado una expresión de proteína sostenida. Los datos sugieren que incluso los ARNm modificados son muy inestables y que la utilización de reactivos de transfección para proteger el ARNm de la degradación es fundamental para la expresión sostenida de proteínas.

Para establecer una ventana de análisis para los estudios metabólicos, se examinó el grado de expresión de la proteína incubando células T HEK 293 con LNP de ARNm de LF durante diferentes tiempos. Las muestras tratadas de forma continua o durante 8 o 12 h produjeron cantidades comparables de actividad dependiente de luciferasa durante el mismo curso de tiempo (Fig. 1c, Tabla complementaria 3). La máxima expresión de proteína se observó a las ~ 15 h para las transfecciones continuas y de 8 h, mientras que la transfección de 12 h mostró una expresión máxima a las ~ 20 h. Todas las transfecciones posteriores se incubaron durante 10 h para maximizar la producción de proteínas y por conveniencia experimental.

La estabilidad y eficacia relativas de los LNP están en función del diámetro y la dispersión de las partículas, que controlan la eficiencia de la biodistribución, la penetración en los tejidos, la carga y liberación de la carga y la absorción celular en los tejidos27,28,29. Para las células cultivadas, se espera que el tamaño de LNP desempeñe un papel menor para permitir la entrega de la carga debido a la ausencia de sistemas circulatorios y linfáticos que minimicen la penetración en los tejidos al eliminar rápidamente las partículas más pequeñas. Los LNP forman estructuras liposomales polidispersas con interiores acuosos estabilizados por una bicapa de surfactante; el núcleo acuoso proporciona un entorno estable para el ARNm, lo que reduce la degradación prematura en relación con el ARNm desnudo30,31. Para determinar el papel del ARNm en la interacción con LF, los LNP se ensamblaron con y sin ARNm y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo para obtener imágenes microscópicas electrónicas (Fig. 2). En ausencia de ARNm, la distribución del tamaño de LNP fue asimétrica con un tamaño medio de partícula de 29 ± 12 nm (Fig. 2a y c). La inclusión de la carga de ARNm en los LNP de LF dio como resultado una población de tamaños de partículas más grande y menos polidispersa con una media de 135 ± 12 nm (Fig. 2b y d) que cae dentro del rango, 100-200 nm, de los utilizados con éxito para administrar medicamentos contra el cáncer a tumores altamente permeables32.

El tamaño de las nanopartículas de lípidos se estabiliza mediante el ARNm. ( a ) Micrografía electrónica de liposomas sin ARNm. ( b ) Micrografía electrónica de liposomas que contienen ARNm de luciferasa. ( c ) Distribución de tamaños de los LNP sin ARNm. ( d ) Distribución de tamaños de los LNP que contienen ARNm de luciferasa. La curva de Gauss se dibujó para facilitar la visualización comparativa de la distribución.

Se agregó la capacidad de seguimiento de pulsos al biorreactor33 de RT, NMR en tiempo real descrito anteriormente. El biorreactor mantiene altos niveles de metabolitos que contienen fosfato durante > 24 h, lo que es consistente con una alta carga de energía y células metabólicamente activas33. Las células HEK 293T se empaquetaron como se describió anteriormente en pequeñas perlas de alginato de ~ 0,6 mm de diámetro mediante el uso de un atomizador20 y Krebs-Henseleit modificado, KH, tampón34, un medio sin suero clásico definido químicamente35 utilizado para estudiar cardiomiocitos. Las sales tampón KH se complementaron con glucosa, albúmina de suero bovino, BSA, insulina y ácido palmítico. La característica crítica del biorreactor es un vástago de irrigación microporoso (Fig. 3a) que permite la distribución uniforme del medio fresco a través de perlas de células empaquetadas33 en un tubo de RMN de 5 mm y facilita el intercambio rápido del medio del volumen de muestreo de RMN de ~ 200 µL. Se administró un pulso de 15 ml de [U, 13C]-glucosa etiquetada uniformemente a través de un circuito de inyección conectado en línea con el tubo de administración del medio y controlado por un interruptor mecánico (Fig. 3a). Para evitar la formación de burbujas de aire, el diámetro interior del tubo se hizo coincidir con los orificios de las uniones en todo el dispositivo. El flujo se controló mediante una bomba peristáltica para administrar 100–200 ul/min. El rendimiento del dispositivo se optimizó para introducir un pulso de glucosa marcada con un tiempo de subida, ~ 10 min, que es más rápido que el tiempo característico de la glucólisis, 10-20 min36. Para ello se ajustó la temperatura experimental a 300 K para enlentecer el metabolismo celular37. Las ejecuciones de optimización mostraron que 10 millones de células empaquetadas en perlas de alginato y alimentadas mediante el uso de un tallo de irrigación microporoso pueden consumir ~ 25 % de la glucosa 13C administrada durante el transcurso del experimento (Figura 2 complementaria).

Espectroscopía de RMN pulso-persecución en tiempo real. ( a ) Biorreactor utilizado para RT-PC NMR. El biorreactor modificado incluye un circuito inyectable para experimentos de persecución de pulsos o una válvula para experimentos de persecución por pasos. (b) Coherencia cuántica única heteronuclear editada con 13C, 1H-13C HSQC, espectro de RMN que muestra los metabolitos presentes en la célula. Los recuadros muestran la división de picos cruzados de metabolitos y los picos cruzados de glucógeno. La proyección del HSQC 2D 1H-13C en la dimensión del protón está en la parte superior del espectro. El pico de etanol surge porque se usó etanol para solubilizar el suplemento de ácido palmítico en el tampón KH modificado. Los picos no marcados de los metabolitos, que no se usaron para el análisis debido a una baja relación señal/ruido o al solapamiento con los picos de glucosa o tampón después de la proyección en el eje 1H, se indican con un asterisco. (c) Pulsos de 13C-glucosa normalizados perseguidos con glucosa sin marcar en células HEK 293T no transfectadas: (I) Antes del pulso, las células se alimentan con glucosa sin marcar en tampón KH modificado; (II) Durante la etapa de incorporación se introduce un pulso de 15 mL de 13C-glucosa a través del asa inyectable; (III) la 13C-glucosa alcanza una concentración meseta; (IV) Durante la etapa de aclaramiento se elimina del sistema la 13C-glucosa. Durante todas las etapas, los metabolitos individuales se monitorean a medida que avanzan a través de las rutas metabólicas. Los trazos rojos y negros representan muestras biológicas replicadas. (d) Tiempos de subida y bajada para los bordes anterior y posterior, tRG y tFG, de los pulsos que se muestran en el panel c.

El nivel de ATP de las células se controló antes y después de cada experimento mediante la recopilación de un espectro de RMN de fósforo. Las células vivas mantienen niveles homeostáticos de ATP que se pueden discernir fácilmente en un espectro 1D. Los resultados no mostraron una reducción en los niveles de ATP en el transcurso de cada experimento (Figura 3 complementaria). El pH intracelular se estimó entre 7,2 y 7,5 en base a la diferencia en los picos de fosfocreatina, PCr y fosfato inorgánico, Pi, en -3,18 ppm y 2,13 ppm, respectivamente38,39. La oxigenación se evaluó mediante la relación PCr/ATP y se encontró que era ~ 0,6, que está en el rango normalmente observado para los riñones de rata perfundidos (Figura 3 complementaria)40. Esta proporción no cambió durante el transcurso del experimento y mostró que, a pesar del empaquetamiento denso en perlas de alginato, las células no estaban hipóxicas41,42.

Se usaron experimentos de RMN de protones editados con 13C unidimensionales43 para controlar el carbono que se metabolizó a partir de la glucosa marcada isotópicamente43. Dado que las señales de protones de los metabolitos se superponen, primero se adquirió un espectro de RMN de coherencia cuántica única heteronuclear editado con 13C bidimensional, HSQC43, para identificar los metabolitos presentes en el espectro de protones (Fig. 3b). Solo los picos de Hγ–Cγ de glutamato, Hβ–Cβ de alanina y Hγ–Cγ de lactato no se superpusieron después de proyectarse a la dimensión del protón (Fig. 3b). Las divisiones observadas en la dimensión del carbono mostraron que el lactato, la alanina y el glutamato eran productos de la glucólisis y un solo ciclo de TCA (recuadros de la Fig. 3b)44. Debido a la alimentación continua de glucosa, no se esperaba una contribución significativa de la gluconeogénesis. Los picos no superpuestos correspondientes a lactato, alanina y glutamato tuvieron la fuerza suficiente para reducir el tiempo de adquisición a 47 s, que fue la resolución temporal de los experimentos.

En la Fig. 3c se muestra un perfil de pulso para 13C-glucosa en células HEK 293T no tratadas. Hubo un rápido aumento en la señal cuando la glucosa marcada isotópicamente entró en el tubo de RMN. La señal alcanzó una concentración de meseta y disminuyó a medida que la glucosa no marcada perseguía a la 13C-glucosa. La no idealidad de los bordes anterior y posterior del pulso de glucosa se describe mediante los tiempos de subida y bajada, tRG y tFG, respectivamente, que se resolvieron ajustando el perfil de seguimiento de pulso a una asociación/decaimiento exponencial de una sola fase (Figura complementaria 4 y Tabla Suplementaria 4). Las tasas diferenciales de difusión surgen a medida que el pulso entra y sale del sistema, lo que da como resultado tiempos de caída significativamente más largos (Figura 5 complementaria). Estas diferencias son en parte el resultado de la variación en la densidad de empaquetamiento celular asociada con cada muestra física.

Las células HEK 293T se cultivaron en OptiMEM en placas y se dejaron sin tratar (control) o se trataron durante la noche con LF o LF-mRNA. Se controlaron los destinos del lactato, la alanina y el glutamato a medida que se metabolizaba la glucosa marcada (Fig. 4). Cada experimento tardó ~ 6 h en completarse y se repitió al menos dos veces usando réplicas biológicas. A diferencia de la glucosa marcada, las intensidades máximas de los picos cruzados de los metabolitos variaron en un factor de dos entre los experimentos individuales, mientras que el perfil de tiempo permaneció sin cambios. La variación en la concentración absoluta de metabolitos con cada preparación celular refleja la heterogeneidad inherente (clonal) de las células vivas presentes incluso sin cambios en el crecimiento y no es inesperada para muestras biológicas replicadas45,46. Las intensidades de los picos cruzados de metabolitos aumentaron a medida que los metabolitos marcados ingresaban al grupo libre después de la biosíntesis y disminuían a medida que se unían transitoriamente o se incorporaban a biomoléculas más grandes, o se eliminaban del grupo libre cuando la glucosa marcada se eliminaba del sistema.

Perfiles de flujo cinético escalados de metabolitos en células HEK 293T. (a) Ilustración que muestra la disposición metabólica de 13C-glucosa observada durante un experimento de RTPC-NMR. ( b ) Perfiles de flujo cinético de metabolitos resultantes de un pulso de glucosa 13C de 15 ml en células HEK 293T y una alimentación continua de glucosa 13C en células HEK 293T tratadas durante 10 h con LF. Los trazos rojos y negros representan muestras biológicas replicadas.

En condiciones de flujo de nutrientes uniforme, el borde anterior/posterior de los perfiles de persecución de pulso exhibió aumentos/disminuciones exponenciales en la concentración de metabolito libre. Para estimar los parámetros cinéticos para la producción de metabolitos marcados individuales, se escalaron los KFP de dos experimentos y los bordes de ataque se ajustaron a un exponencial de dos fases que tiene en cuenta la forma real del pulso de glucosa 13C:

donde y es la concentración relativa de metabolito libre, tP es el tiempo de producción requerido para que las señales del metabolito alcancen una saturación de ~63%, yPo es la concentración relativa cuando la señal comienza a aumentar, y ARo y AP son constantes. Para estimar los parámetros cinéticos para la eliminación de metabolitos marcados del grupo libre, los bordes de salida de los perfiles también se ajustaron a una exponencial de dos fases:

donde tC es el tiempo de aclaramiento para una reducción del 63% en las señales del metabolito, yCo es la concentración relativa cuando la señal comienza a disminuir, y AFo y AC son constantes. El primer término en las Ecs. (1) y (2) tiene en cuenta la no idealidad de los pulsos de glucosa 13C debido a la difusión (Fig. 3c y d y Tabla complementaria 4) cuando tRG y tFG no son mucho más cortos que tP y tC de los metabolitos.

Las células HEK 293T de control que no se sometieron a tratamiento con LF o LF-mRNA exhibieron perfiles de borde anterior y posterior bien definidos para lactato, alanina y glutamato (Fig. 4). Los niveles de lactato alcanzaron un estado estacionario isotópico47 que persistió hasta que se alcanzó la glucosa etiquetada. La alanina exhibió una pequeña disminución constante en los niveles de meseta bajo condiciones de control. El perfil de glutamato alcanzó un máximo aproximadamente en el momento en que se extrajo del sistema el pulso de glucosa marcado.

Las constantes de tiempo promedio resueltas para la producción, tP y el aclaramiento, tC, fueron 14 y 26 min para el lactato y 13 y 30 min para la alanina, respectivamente (Tabla complementaria 5 y Figuras complementarias 6 y 7) consistentes con el hecho de que el lactato, que se deriva del piruvato, y la alanina son productos de la glucólisis, que es la vía metabólica más rápida y ocurre en el citosol (Fig. 4). El glutamato, que se sintetiza en las mitocondrias a partir de α-cetoglutarato durante el ciclo TCA, mostró los tiempos promedio más lentos, 75 y 60 min para la producción y eliminación, debido a su dependencia de los productos de la glucólisis y la lenta importación y exportación de metabolitos hacia y desde mitocondrias (Tabla complementaria 5 y Figura complementaria 8).

Los perfiles de flujo cinético de lactato y alanina en las células tratadas con LF o LF-ARNm fueron cualitativamente similares a los controles (Fig. 4) que mostraron aumentos pequeños pero significativos en tC en relación con tP (Tabla complementaria 5) debido a la fracción unida del metabolito marcado o sus precursores (Tabla complementaria 5, Fig. 5a). El tiempo de eliminación persistentemente más lento para el lactato y la alanina reflejó un aumento en la concentración de metabolitos libres marcados a medida que se intercambiaban fuera de la fracción unida y se utilizaban para el metabolismo en curso. Las diferencias entre tP y tC para glutamato no fueron significativas (Tabla complementaria 5, Fig. 5a), muy probablemente porque la concentración intracelular libre de glutamato es típicamente ~ 20 veces mayor que lactato o alanina48, de modo que el glutamato marcado unido no altera sustancialmente la concentración libre. La desviación más notable se observó para la alanina en células expuestas a LF (Fig. 4) para las cuales la meseta de estado estacionario isotópico observada en las células de control fue reemplazada por una disminución monotónica en la intensidad de la señal seguida de una disminución exponencial rápida cuando el pulso de glucosa marcado era remoto. Los niveles de alanina en estado estacionario isotópico se restauraron cuando las células se trataron con ARNm de LF.

Evaluación estadística de las diferencias entre los parámetros KFP (a) tiempos de producción y despacho, tP y tC; (b) tiempos característicos, tch = 2/(1/tP + 1/tC), (c) parámetros de unión, K = (1/tP—1/tC)/2, para cada metabolito, y (d) las pendientes de KFP de alanina después del tratamiento con LF y LF-mRNA. Los puntos representan puntos de datos obtenidos utilizando muestras biológicas replicadas. Las estrellas indican significación: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***).

Cabe señalar que también se detectó lactato en el flujo del biorreactor y, por lo tanto, se excreta de las células (Figura 2 complementaria), pero la tasa de excreción, ~ 1/20 min−1, que es la tasa de producción de lactato (Tabla 1) , es mucho más lento que el caudal de nutrientes de 200 uL/min dividido por el volumen de muestreo de RMN de 200 µL (1 min−1). Como resultado, se observa principalmente lactato marcado intracelular. Los tiempos de producción de lactato y alanina, tP, fueron significativamente más lentos en las células T HEK 293 tratadas con ARNm de LF en comparación con el control (Fig. 5a; Tabla complementaria 5). Los perfiles de glutamato exhibieron un error experimental consistentemente mayor en las células tratadas con LF o LF-mRNA. Esto podría ser el resultado del ruido de muestreo inherente a las réplicas biológicas o una indicación de actividad mitocondrial aberrante o ambos.

La incorporación de metabolitos en estado estacionario isotópico en la fracción unida y la acumulación de metabolitos libres en todas las condiciones se puede explicar mediante un modelo simple de competencia por los sitios de unión (véanse las ecuaciones (14) y (15)). El modelo predice que la competencia entre los metabolitos marcados y no marcados por los sitios de unión acortará el tP y alargará el tC (ecuaciones 11 y 13, tabla complementaria 5, figura complementaria 9). En este modelo, el tiempo característico del flujo de metabolitos, tch, es igual a la media armónica entre tP y tC y el parámetro de unión característico que describe el tiempo de incorporación y liberación de la glucosa marcada en la fracción unida, K, es igual a la mitad de la diferencia entre 1/tP y 1/tC y es equivalente a la tasa de encendido por la concentración de sitios de unión (Tabla 1).

No se resolvieron diferencias significativas en tch para el metabolismo del lactato y el glutamato después del tratamiento con LF o LF-mRNA o para alanina tratada con LF (Tabla 1, Fig. 5), lo que indica que los flujos metabólicos glucolítico y mitocondrial no se vieron afectados. Hubo un aumento significativo en la tch para el metabolismo de la alanina en presencia de ARNm de LF en relación con las células de control (Fig. 5b). El aumento es indicativo de un cambio en el metabolismo de la alanina en las células tratadas con ARNm de LF, lo que podría implicar un mayor tiempo de utilización de la reserva libre de alanina que da como resultado una fracción unida más alta y/o una disminución en la producción de alanina. Sin embargo, los valores de K resueltos para cada metabolito no fueron significativamente diferentes, lo que implica que la distribución metabólica de los metabolitos unidos y libres no se vio afectada por la presencia de LF o LF-mRNA (Fig. 5c; Tabla 1). Los valores negativos resueltos para el glutamato se debieron al gran error asociado con esas mediciones.

Para investigar más a fondo las perturbaciones asociadas con el metabolismo de la alanina, se aplicó una función escalonada de glucosa marcada a las células tratadas con LF durante 10 h (Fig. 4). El circuito de inyección se reemplazó con una válvula que cambiaba el flujo de entrada a un depósito que contenía medio de glucosa 13C. El lactato y el glutamato mostraron un comportamiento de estado estacionario isotópico, pero el perfil de alanina alcanzó un valor máximo y disminuyó monótonamente durante el transcurso del experimento, que duró aproximadamente el doble que los experimentos de pulso. La disminución en la intensidad de la señal de meseta para la alanina se analizó ajustando los perfiles de meseta de alanina a una función lineal (Tabla complementaria 6; Fig. 5d). El valor promedio de la pendiente resuelta para las células tratadas con LF, 0,005 min−1, tenía una tendencia 2,5 veces mayor que el control y, significativamente, 5 veces mayor que en las células tratadas con LF-mRNA (Tabla complementaria 6), lo que indica un proceso muy lento (Figura 5d). Debido a que la distribución de alanina unida y libre no se vio afectada y la pequeña cantidad de alanina excretada permaneció constante durante el experimento (Figura 10 complementaria), la pendiente de la meseta de alanina probablemente refleja una disminución en la biosíntesis de alanina. La mayor parte de la síntesis de alanina depende de la disponibilidad de glutamato, que se deriva de α-cetoglutarato, un producto del ciclo TCA en las mitocondrias, en la biosíntesis de alanina por amidación de piruvato y puede indicar un transporte deficiente de glutamato fuera de las mitocondrias (Fig. 4a). También es posible que los niveles de alanina se vean influenciados por el recableado del metabolismo de la glutamina en mitocondrias defectuosas49 y, si las mitocondrias se ven comprometidas por la generación de especies reactivas de oxígeno, ROS, entonces la producción de glutamato también puede verse comprometida. Cualquiera de las condiciones podría conducir a una reducción en el tiempo de biosíntesis de alanina.

Se ha observado alteración de la función mitocondrial, despolarización de la membrana y falla en el transporte de electrones en células progenitoras neuronales tratadas con lipofectamina50. La fuga de electrones del sistema de transporte de electrones en la membrana interna conduce a una reducción parcial de oxígeno para formar superóxido, un ROS, que en última instancia puede provocar mitofagia. Para examinar si la función mitocondrial puede verse afectada por LF, las células HEK 293T se trataron con MitoSOX, que emite fluorescencia cuando se oxida con ROS mitocondrial, se tomaron imágenes (Fig. 6a) y se analizaron (Fig. 6b).

Producción de ROS en células HEK 293T en respuesta a la exposición a LNP con y sin ARNm. (a) Las células teñidas con MitoSOX revelan la presencia de ROS (coloreadas en rojo). La tinción Deep Red FM (coloreada en verde) muestra mitocondrias intactas. Los paneles superpuestos indican que las ROS se originan en las mitocondrias. ( b ) Cuantificación de la fluorescencia de MitoSOX en las células. Los puntos representan puntos de datos obtenidos usando muestras técnicas replicadas. Las barras de error representan la desviación media. Las estrellas indican significación: p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***).

El tratamiento de las células con un control positivo para ROS, la antimicina A, que se une al sitio activo de Qi en la citocromo c reductasa e inhibe la respiración celular, resultó en un aumento significativo de ROS mitocondriales en comparación con las células no tratadas (Fig. 6b)51. Las células tratadas con LF e incubadas durante 4 h exhibieron niveles significativamente más altos de ROS en comparación con las células no tratadas, y esa diferencia aumentó con incubaciones más largas de 28 h. La inclusión de ARNm en el LNP condujo a niveles significativamente más bajos de ROS en relación con LF solo, similar a las células no tratadas después de una incubación de 4 h (Fig. 6b) y restauró la meseta de estado estacionario isotópico para alanina en la metabolómica de RTPC-NMR en la célula experimentos (Fig. 4). La tinción de mitocondrias intactas y dsDNA no indicó diferencias en las reacciones mitofágicas o autofágicas (Fig. 6a). Por lo tanto, la aparente disminución en la biosíntesis de alanina puede deberse a la disfunción mitocondrial inducida por LF, dando lugar a ROS.

A medida que las vacunas de ARNm mediadas por LNP están cada vez más disponibles como tratamiento terapéutico, se vuelve más importante comprender el efecto de las LNP en las células y los tejidos5. Los ARN mensajeros solos son demasiado inestables para usarse como agentes de transfección, incluso aquellos que contienen bases modificadas. El ARNm debe estar protegido por LNP específicos para que la célula lo utilice de manera efectiva. Pero los LNP son tóxicos50. La porción lipídica del análogo de la vacuna pareció provocar una disfunción de la membrana mitocondrial en forma de un aumento de ROS, cuyos efectos se aliviaron mediante la inclusión de ARNm en los LNP. Las células HEK 293T tratadas con LNP que contenían ARNm pudieron acceder a los nutrientes y producir proteínas durante más de 24 h, lo que implica que la liberación inevitable de pseudouridina tras la degradación del ARNm no inhibió la transcripción del producto de ARNm. La técnica es sensible a los metabolitos libres, pero contiene información sobre el grupo de metabolitos unidos covalentemente, como en el glucógeno52, o no covalentemente, como en las interacciones proteína-ligando53. El uso de la metabolómica en células como tecnología emergente para evaluar los efectos dañinos de los LNP puede ayudar a optimizar su eficacia y abordar posibles efectos no deseados54.

La mayoría de las metodologías metabólicas brindan una instantánea de la fisiología celular que altera la distribución entre los metabolitos libres y unidos al interrumpir la partición intracelular y diluir el grupo metabólico36. La RMN de seguimiento de pulsos en tiempo real evita estas complicaciones al introducir un pulso de glucosa 13C marcada isotópicamente en las células dentro de un biorreactor y monitorear directamente los tiempos de incorporación y eliminación de los metabolitos marcados dentro de las células vivas. Mediante el empleo de secuencias de pulsos de RMN de protones editadas con 13C unidimensionales, solo se observan los compuestos marcados. La intensidad de la señal de RMN aumenta cuando se introduce 13C-glucosa a medida que se generan niveles intracelulares de metabolitos libres marcados y disminuye a medida que se incorporan al metabolismo intermediario, se unen o eliminan transitoriamente del sistema cuando se elimina el pulso. El breve tiempo de adquisición espectral proporciona una resolución temporal de 47 s, lo suficientemente rápido como para observar el inicio de procesos rápidos como la glucólisis.

Se demostró que la espectroscopia RTPC-NMR es eficaz para monitorear la actividad de las vías de producción de energía en células HEK 293T en condiciones de flujo de nutrientes isotópico en estado estacionario en respuesta a un análogo de vacuna mRNA-LNP e identificar cambios en los flujos metabólicos debido a la introducción de compuestos terapéuticos. Tres especies se resolvieron bien en los espectros de RMN editados con protón 13C, lactato, alanina y glutamato; estos se encuentran entre los metabolitos más abundantes dentro de una célula48. La acumulación de metabolitos siguió una progresión bien entendida de vías metabólicas que participan en la extracción de energía celular. Los perfiles cinéticos generados para cada uno se analizaron usando cinética de primer orden para producir constantes de tiempo, tP y tC, para la producción y eliminación de metabolitos marcados de las células, respectivamente. Los parámetros obtenidos experimentalmente resolvieron los tiempos característicos de los flujos metabólicos, tch, así como la contribución de la fracción unida de metabolitos al flujo, K. El lactato y la alanina se produjeron más rápidamente a través de la glucólisis, que tiene lugar en el citosol y responde inmediatamente a la presencia de glucosa. La síntesis de glutamato en las mitocondrias, que se basa en los productos de la glucólisis y el ciclo TCA, ocurrió más lentamente (Tabla 1).

La rápida acumulación de lactato y alanina observada en condiciones de control no se vio perturbada en su mayoría por la adición de LNP con o sin ARNm. Los tiempos de eliminación consistentemente más lentos resultaron de la incorporación de metabolitos marcados libres o sus precursores en la fracción unida, que se liberó lentamente a medida que se perseguía el pulso de las células. El aumento significativo en el tiempo característico para la alanina en las células tratadas con ARNm de LF es indicativo de la carga metabólica descrita anteriormente de la producción de proteínas recombinantes que da como resultado un crecimiento celular más lento55 y una disminución de la glucólisis aeróbica56,57. Distintos cambios en el perfil de meseta para la eliminación de alanina implicaron disfunción mitocondrial en la exportación de glutamato como consecuencia del tratamiento de las células con LNP solo, mientras que la producción de glutamato a través del ciclo TCA permaneció imperturbable. Este postulado fue respaldado por la presencia de ROS en células tratadas con LNP. La extensión de ROS se redujo significativamente y el comportamiento de control se restableció en gran medida al incluir ARNm en los LNP. Los resultados sugieren que la alanina puede funcionar como una sonda sensible para la toxicidad inducida por LNP.

Se demostró que la incorporación de ARNm en LNP es necesaria para una fuerte expresión génica. La encapsulación del ARNm aumentó el tamaño promedio de los LNP de 29 a 135 nm y dio como resultado una dispersión más simétrica, parámetros críticos para la estabilidad y la eficacia. En este trabajo se utilizó el protocolo del fabricante para preparar LNP con y sin ARNm. No se intentó variar la distribución de tamaños de las partículas resultantes.

Los LNP internalizados difunden a través del medio celular a una velocidad inversamente proporcional a su tamaño. Especulamos que la rápida difusión de LNP más pequeños junto con la mayor estabilidad que brinda la ausencia de interacciones lípido-ARN dará como resultado LNP de larga duración y penetración más profunda donde pueden interactuar y dañar las estructuras membranosas internas, incluidas las mitocondrias. Esto puede explicar cómo los LNP vacíos provocan una mayor producción de ROS que aquellos que están cargados y, en combinación con el requisito de una exportación mitocondrial adecuada de glutamato en la biosíntesis primaria de alanina, por qué solo los perfiles de alanina difieren en ausencia y presencia de ARNm. .

Se adquirieron células de riñón embrionario humano, HEK293T, de la American Type Culture Collection y se cultivaron de acuerdo con las condiciones recomendadas. N1-metilpseudouridina-trifosfato se adquirió de TriLink Biotechnologies. Los reactivos de transfección Fugene 6, Fugene HD, ViaFect y el kit Luciferase Assay System se obtuvieron de Promega. La PEI lineal (25 kDa) se adquirió de Polysciences, la rotenona de MP Biomedicals y la antimicina A de Sigma-Aldrich. Lipofectamine 2000, LF, medio de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, medio de suero reducido Opti-MEM, solución salina tamponada con fosfato, PBS y MitoSOX eran de ThermoFisher Scientific. El plásmido pTK305 utilizado para la transcripción in vitro del ARNm de luciferasa de luciérnaga se adquirió de Addgene (n.º de plásmido 66.812; http://n2t.net/addgene:66812; RRID:Addgene_66812).

El plásmido pTK305 se amplificó y linealizó con la enzima de restricción AscI (New England Biolabs), se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol/acetato de amonio. El ADN linealizado se volvió a disolver en tampón Tris-EDTA, TE, libre de ARNasa a una concentración de 1 mg/mL y sirvió como molde para la transcripción in vitro utilizando el kit de transcripción MEGAscript T7 (Ambion) con nucleótidos no modificados o con N1- metilpseudouridina-trifosfato reemplazando a uridina-trifosfato en la reacción. La síntesis de ARNm se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARNm resultante se purificó por precipitación con cloruro de litio 7,5 M, EDTA 50 mM, LiCl/EDTA, durante ≥ 30 min a -20 °C. El sedimento se disolvió en agua libre de ARNasa.

Para introducir la estructura Cap1 en el extremo 5', se desnaturalizó el ARNm a 65 °C durante 10 min y se utilizó el sistema de tapado ScriptCap™ Cap1 (Cellscript) según las instrucciones del fabricante. La reacción se terminó añadiendo medio volumen de solución de LiCl/EDTA y se volvió a disolver en agua libre de ARNasa. Para agregar una cola poli(A) de 3', el ARNm se desnaturalizó nuevamente a 65 °C durante 10 minutos y se usó el kit de colas de polimerasa A-Plus™ Poly(A) (Cellscript) de acuerdo con las pautas del fabricante. La reacción se incubó a 37 °C durante 2 horas y se terminó agregando EDTA a 15 mM. El ARNm se purificó añadiendo un volumen igual de acetato de amonio 5 M, incubando en hielo y centrifugando el precipitado. El ARNm de N1-metilpseudouridina poliadenilado y rematado resultante se disolvió en agua libre de ARNasa a una concentración de 1 mg/ml, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 °C.

Las células HEK 293T se cultivaron en medio completo, medio de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM suplementado con L-glutamina 4 mM, D-glucosa 5,5 mM, piruvato de sodio 1 mM, suero bovino fetal al 10 % (HyClone), 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Para determinar la eficacia de la transfección, las células se transfectaron con cinco reactivos diferentes en una placa de 24 pocillos, 2 pocillos para cada transfección. Cada pocillo se sembró con 5 × 104 células en 0,5 ml de DMEM/FBS al 10 % 24 h antes de la transfección y se incubó en una cámara de crecimiento en CO2 al 5 % a 37 °C. El medio de crecimiento se cambió a Opti-MEM/5% FBS y se combinaron 0,5 µg de ARNm de luciferasa con 1,5 µL de FuGENE 6, 1,5 µL de FuGENE HD, 2 µL de ViaFect o 1 µL de LF en Opti-MEM y se incubaron a temperatura ambiente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se combinaron 2,5 µl de 1 mg/ml de polietilenimina lineal, PEI, con 0,5 µg de ARNm de luciferasa en 47 µl de Opti-MEM y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Se usaron células HEK 293T no tratadas como control autoluminiscente. Las mezclas de transfección se transfirieron a placas de pocillos y se incubaron durante 24 h en una cámara de crecimiento. Las células se lavaron con PBS y se lisaron añadiendo 50 µl de reactivo de lisis de cultivo celular de luciferasa 1X (Promega). Se rasparon las células y se centrifugaron los contenidos de los pocillos a 16.000 g durante 5 min. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se almacenaron a -70 °C. Para analizar la actividad de luciferasa, se mezclaron 20 µl de lisado con 100 µl de reactivo de ensayo de luciferasa (Promega) en una placa blanca de 96 pocillos (Greiner Bio-One) y se leyeron inmediatamente en un lector de placas Synergy H1 Hybrid Multi-Mode (BioTek Instruments) . Tenga en cuenta que el reactivo LF utilizado en estos experimentos está compuesto por una mezcla de policatiónicos y fosfolípidos. La formación de LNP que contienen carga de ácido nucleico surge a través de interacciones electrostáticas entre el esqueleto de fosfato del polímero de ácido nucleico y los lípidos cargados positivamente59.

Para los experimentos de evolución temporal, las células transfectadas se cultivaron en placas de 10 cm hasta una confluencia del 60-80 % y se recolectaron con tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco) durante 5-10 min a 37 °C. La tripsina se neutralizó utilizando una dilución quíntuple con medio completo, las células se contaron y sedimentaron mediante centrifugación a 200 g durante 10 min. Las células se resuspendieron en Opti-MEM/FBS al 5 % a una concentración de 0,6–1 × 106 células/mL y se dividieron en alícuotas en tubos Eppendorf de 1,5 mL a 0,5 mL por tubo. Los tubos se incubaron en la cámara de cultivo en una posición inclinada con las tapas abiertas. Para cada transfección, se mezclaron 2 µL de LF con 23 µL de Opti-MEM y se incubaron durante 5 min a 37 °C. Se añadió un µg de ARNm en 25 µL de Opti-MEM y se continuó la incubación durante 20 min. Las mezclas de transfección se agregaron a las células y los tubos se colocaron en la cámara de crecimiento. En los tiempos apropiados, las células se centrifugaron a 200 g durante 5 min, se lavaron con PBS y se lisaron como se describe anteriormente para el ensayo de luminiscencia. Para algunos experimentos, el medio se eliminó después de 8 o 12 h de transfección y se reemplazó con DMEM para una incubación adicional. Cuando se utilizó la microfluídica para la entrega de ARNm (abajo), las células procesadas se resuspendieron en Opti-MEM/FBS al 5 %, se colocaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml a razón de 0,5 ml por tubo, se incubaron en la cámara de crecimiento durante tiempos específicos, se centrifugaron y se lisaron como arriba.

Las células para los experimentos de RMN se cultivaron en placas de 15 cm en 20 ml de DMEM/FBS al 10 % hasta una confluencia del 60 al 80 %. Las mezclas de transfección se escalaron 100 veces, es decir, 200 µl de LF en 2,5 ml de Opti-MEM con o sin 100 µg de ARNm. Después de una incubación de 20 minutos, se agregaron las mezclas de transfección a las placas y se permitió que las transfecciones continuaran en la cámara de crecimiento a 37 °C, 5 % de CO2, durante 10–11 h.

Se sembraron tres placas de cultivo de 15 cm (Corning) que contenían medio de cultivo con 4 × 106 células HEK 293T y se incubaron en CO2 al 5 % a 37 °C durante 48–72 h hasta una confluencia de ~ 80 % (~ 1,2 × 107 células/placa). Las células se recogieron como se describe anteriormente60, se pasaron a través de un filtro de 40 µm para reducir la formación de grumos y la agregación y se contaron. ~ 3 × 107 células se suspendieron en tampón de flujo celular, BSA al 0,4 %, EDTA al 0,04 %, Percoll al 20 % y 5 µL de Tween-20 a las que se añadió ARNm de luciferasa de luciérnaga modificado en tampón de almacenamiento hasta una concentración final de 300 µM y volumen de 3 ml. Se preparó un dispositivo de polidimetilsiloxano, PDMS, Volume Exchange for Convective Transfer, VECT, de dos canales con microcanales rígidos de 9,6 µm como se describió anteriormente61,62. El dispositivo se purgó para eliminar el aire y los desechos utilizando tampón de pasivación, BSA al 1 % en PBS, y se colocó en la platina de un microscopio Vista Vision (VWR) para monitorear el ciclo en caso de burbujas u obstrucciones. La suspensión de células se pasó a través del dispositivo VECT utilizando una bomba de jeringa New Era Pump Systems Modelo 300 a una velocidad de flujo de 100 µL/min. El flujo resultante se recogió y se equilibró durante 20 min a temperatura ambiente para maximizar la transfección y facilitar la recuperación celular. Las células se centrifugaron a 200 g durante 6 min a 25 °C y se lavaron dos veces con 5 ml de PBS para la espectroscopia de RMN en la célula.

Rejillas de microscopía de cobre recubiertas de carbono (malla 300, Electron Microscopy Sciences) se descargaron luminiscentemente usando aire en un limpiador de plasma Harrick durante 30 s. Se aplicaron liposomas y complejos de liposomas-ARNm a la rejilla recién descargada en gotitas de 5 µl y se dejaron adsorber durante 5 min en una placa de tejido cerrada de 15 cm para minimizar la exposición al aire y el secado excesivo. La solución de muestra se volvió a aplicar cuatro veces. Se preparó acetato de uranilo al 2% (p/v) y se mezcló durante la noche en un cuarto oscuro en un nutator de plataforma. La rejilla se tiñó usando 5 µL de acetato de uranilo al 2% durante 1 min depositado directamente sobre la rejilla y se lavó 3 veces con 5 µL de agua destilada ultrapura. El exceso de solución se eliminó mediante transferencia con papel Whatman entre cada paso63.

Las micrografías fueron capturadas usando un Microscopio Electrónico de Transmisión JEOL JEM-1400, TEM, usando una potencia de 80 kV y una cámara XR401 Charge Coupled Device, CCD (AMT Imaging). Las imágenes se capturaron con un tiempo de exposición de 780 ms con aumentos de 30 000, 40 000 y 80 000. Se procesaron un total de 17 imágenes que contenían 1094 partículas en el umbral bajo, medio y alto utilizando el programa Fiji (software ImageJ). Las áreas de partículas individuales se midieron utilizando la función Analizar partículas. Todas las partículas se seleccionaron automáticamente y se revisaron manualmente para omitir valores atípicos, como partículas directamente en el borde de las imágenes o múltiples partículas que se superponen entre sí.

~ 10 × 107 células (~ 500 µL) se mezclaron 1:1 (v/v) con Krebs–Henseleit, KH, sales, HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 2,5 mM, 1,2 mM MgCl2 y NaH2PO4 3 mM que contenía alginato al 2% (Sigma). La mezcla se transfirió a una jeringa de 3 ml y se equipó con una punta Luer-lock conectada a un tubo Tygon de 40 mm (DI 0,79 mm) con una aguja roma de calibre 21. La aguja se orientó a 45° con respecto a la superficie de un vaso de precipitados de 25 ml que contenía CaCl2 150 mM. Las células se inyectaron en un atomizador a 300 µL/min utilizando una bomba de jeringa (New Era Pump System NE-300). El atomizador consistía en una pipeta orientada verticalmente con un flujo de aire de 5,5 L/min. El contacto con la solución de CaCl2 hizo que el alginato se polimerizara en perlas de tamaño uniforme que encapsulaban las células. La solución de CaCl2 se decantó y se reemplazó con 25 mL de sales de KH suplementadas con glucosa 5 mM, palmitato 0,4 mM, BSA 0,4 mM y 70 mU/L de insulina. A continuación, las perlas se transfirieron al biorreactor.

El biorreactor utilizado para recolectar datos metabólicos fue casi idéntico al descrito previamente20 como se muestra en la Fig. 3a. El inyector (Rheodyne) se conectó a la línea de entrada a 120 cm de un depósito calentado que contenía sales de KH frescas complementadas con 12C-glucosa 5 mM y se equipó con un circuito de inyección de 15 ml construido con tubería de polietileno (DI de 1,19 mm, Clay Adams). El bucle contenía sales de KH suplementadas con 13C-glucosa 5 mM, lo que permitió una transición ininterrumpida al medio marcado. Una vez que las perlas se moldearon y se transfirieron al tubo de RMN, las células se equilibraron con glucosa 12C en medio KH para permitir que las perlas se asentaran en su posición final dentro del tubo de RMN y para establecer un estado estable metabólico antes de la introducción de Medio 13C-glucosa. Los espectros de 31P se recolectaron antes de la introducción del medio marcado y al final del experimento para evaluar la carga de energía de las células. La válvula del inyector se cambió para iniciar el pulso del medio etiquetado. El metabolito marcado fue perseguido por el flujo continuo de medio sin marcar. El flujo se recogió en incrementos de 1,8 ml para evaluar la fuga celular y la exportación de metabolitos de las células mediante la adquisición de espectros HSQC por separado.

Todos los espectros de RMN se registraron a 300 K usando un espectrómetro de RMN Avance III de 600 MHz equipado con una criosonda QCI-P (Bruker). Los espectros de 1H editados con isótopos 13C unidimensionales se adquirieron con 32 barridos utilizando el experimento de coherencia cuántica única heteronuclear editado con 13C, HSQC43. Los anchos espectrales en las dimensiones 1H y 13C fueron 16 y 80 ppm respectivamente y fueron digitalizados por 2048 y 1 puntos en las dimensiones 1H y 13C, respectivamente. El tiempo de adquisición para cada espectro transitorio fue de 47 s. Para cada experimento, se recogió un espectro de 1H editado con isótopo 13C antes de la inyección de la glucosa marcada con 13C para establecer una lectura de referencia de los metabolitos presentes en la muestra. Después de la inyección, se recogieron 500 espectros de forma consecutiva durante un período de 5,5 horas, lo que permitió controlar la disposición de la 13C-glucosa a medida que avanzaba a través de diferentes rutas metabólicas. Se adquirió un espectro de correlación 13C-1H bidimensional con 32 exploraciones utilizando un programa de pulsos HSQC editado con 13C43. Los anchos espectrales en las dimensiones 1H y 13C fueron de 16 y 80 ppm respectivamente y fueron digitalizados por 2048 y 512 puntos en las dimensiones 1H y 13C, respectivamente.

Antes de cada ensayo, se recogió un espectro de 31P desacoplado de protones con exploraciones de 5 k y un retraso de reciclaje de 1 s para permitir evaluar el estado metabólico de la célula. El espectro de 31P se centró en -10 ppm, correspondiente a 242,935 MHz, y el ancho espectral en la dimensión de 31P fue de 30 ppm. La intensidad máxima de 31P a -11,5 ppm contiene α-ATP, α-ADP, NAD+ y NAD(H), que son metabolitos vitales que se pueden utilizar para evaluar la vitalidad celular20. Todos los espectros se procesaron con Topspin versión 3.2 (Bruker).

Para los estudios metabólicos, los espectros de HSQC 1H-13C se procesaron con Topspin (v3.2, Bruker) y MatLab con scripts internos (métodos complementarios). Las intensidades máximas se calcularon como I = (I/HEPES)–(Iref/HEPESref), donde I/HEPES representa la intensidad máxima normalizada antes de restar el fondo, Iref/HEPESref, y HEPES es la intensidad máxima de HEPES a 3,08 ppm. El número de cada experimento HSQC en la serie se indexó con una intensidad normalizada correspondiente para glutamato, alanina y lactato a 2,28, 1,41 y 1,26 ppm, respectivamente. Esto se trazó en GraphPad Prism para crear una visualización x,y del pulso/pico medio suplementado con 13C para cada metabolito en el transcurso de cada experimento.

Se analizó el cambio de intensidad de cada pulso de metabolito a lo largo del tiempo. Los tiempos para los bordes anterior y posterior del pulso se determinaron a partir de modelos de regresión exponencial que proporcionaron el mejor ajuste. Se usó el modelo de asociación de una fase de GraphPad Prism para ajustar las intensidades de glucosa 13C en el borde de ataque del pulso

y se usó el modelo de decaimiento de una fase para ajustar el borde de salida

donde \({\mathrm{Y}}_{\mathrm{o}}\) es la intensidad inicial de un pico en el tiempo cero, Plateau es la intensidad máxima (para asociación) y mínima (para decaimiento) del pico, K = 1/tRG o 1/tFG son las constantes de tiempo recíprocas de subida y bajada respectivamente, y t es el tiempo en segundos. Dado que la concentración de glucosa intracelular, ~ 0,5 mM64, es diez veces menor que la concentración de glucosa en el tampón KH (5 mM), la contribución de la glucosa intracelular a la señal de RMN de glucosa total es insignificantemente pequeña.

Para el lactato, la alanina y el glutamato, se usó el modelo de asociación de dos fases de GraphPad Prism para ajustar las intensidades en el borde de ataque del pulso.

donde K = 1/tP, la constante de tiempo recíproca para la producción de metabolitos y 0 ≤ x ≤ 1 es un parámetro que asigna el porcentaje de cada componente exponencial al ajuste general. Tenga en cuenta que ARo y AP en la ecuación. 1 corresponden a x(Meseta –Yo) y (1-x)(Yo – Meseta), respectivamente. El modelo de descomposición de dos fases se utilizó para ajustar el borde de salida

donde K = 1/tC, la constante de tiempo recíproca para la eliminación de metabolitos. Tenga en cuenta que AFO y AC en la ecuación. 2 corresponden a x (Meseta–Yo) y (1-x)(Yo–Meseta), respectivamente. Según los resultados de ajuste, los valores de x en (5) y (6) son insignificantemente pequeños (Tabla complementaria 7).

En el borde de ataque del pulso de glucosa 13C, los cambios en la concentración del metabolito A* marcado con 13C libre, con flujo, J y concentración isotópica en estado estacionario A, a lo largo del tiempo t, pueden describirse mediante un perfil de flujo cinético estándar, KFP , ecuación65,66 teniendo en cuenta la no idealidad del pulso de glucosa 13C y añadiendo un término fenomenológico f1(A*, t) que describe la posibilidad de que el metabolito esté unido covalentemente o no covalentemente a un receptor demasiado grande a observar por RMN:

La ecuación describe la evolución temporal de metabolitos intracelulares como la alanina y el glutamato. Para los metabolitos excretados como el lactato, la tasa de dilución, DR, en el volumen de muestreo de RMN de ~ 200 µL, V, del biorreactor es igual a F/V67, donde F, la velocidad de flujo del biorreactor es de ~ 200 µL/min. El tiempo de dilución, 1/DR ~ 1 min, es mucho más corto que tP y tC, los tiempos característicos de la producción y eliminación del metabolito marcado. Por lo tanto, los metabolitos extracelulares se evacuan rápidamente del volumen activo y no contribuyen a la señal de RMN observada.

Suponiendo que el metabolito marcado sufre un intercambio químico entre los estados libre y unido en presencia de la contraparte no marcada y que la concentración de metabolitos unidos es mucho menor que la concentración total de metabolitos o la concentración de sitios de unión, f1(A*, t) el término se convierte en 68 (véanse también las ecuaciones (18) y (21)):

donde K es el parámetro de unión característico y α es la tasa de unión característica. Es importante señalar que el término KA* exp(–αt) se aproxima a cero cuando el tiempo tiende a infinito, lo que refleja el hecho de que no se observará ningún cambio de concentración neto debido a la unión cuando el sistema se equilibre con los metabolitos marcados. La solución de esta ecuación diferencial de primer orden se puede encontrar sustituyendo la Ec. (8) en la ecuación. (7)

y usando el factor integrante, IF69

En general, la solución de (9) sólo es posible numéricamente. Sin embargo, la expresión de IF se simplifica cuando la unión del metabolito no es específica y αt < < 1. En este caso, la solución de la ecuación. (10) se reduce a

donde yo1, AoR y A1 son constantes determinadas para ajustarse al perfil de flujo cinético en el borde de ataque (aumento) del pulso de 13C-glucosa. Tenga en cuenta que tP = 1/(J/A + K) es la escala de tiempo característica del aumento en la señal del metabolito observada en RMN para el borde de ataque del pulso de glucosa 13C y numéricamente corresponde al tiempo necesario para pasar de la condición inicial a 1/e ~ 0,63 del nivel de saturación. Es importante destacar que tP es más corto que el tiempo característico tch = A/J65,66 para el cambio en la concentración total del metabolito marcado. Este resultado confirma que la unión de metabolitos intracelulares modula KFP en metabolómica basada en RMN en células.

En el borde posterior del pulso de 13C-glucosa, los cambios en la concentración de un metabolito libre marcado con 13C, A*, también pueden describirse mediante la ecuación KFP al tener en cuenta la no idealidad del pulso de 13C-glucosa y agregar el término fenomenológico f2(A*, t) = KA* exp(–αt)

Suponiendo que la misma condición, αt < < 1, se cumple, la solución de la ecuación. (10) se reduce a

donde yo2, AoF y A2 son constantes determinadas para ajustarse al perfil de flujo cinético en el borde de fuga (caída) del pulso de 13C-glucosa. Obsérvese que el tiempo característico del aclaramiento en la señal del metabolito observada por RMN, tC = 1/(J/AK), es mayor que tP. En este caso, los parámetros característicos de tiempo y unión, tch y K, se definen como tch = 2/(1/tP + 1/tC) y K = (1/tP−1/tC)/2. Este resultado demuestra que la unión de metabolitos intracelulares conduce a una KFP asimétrica con respecto al aumento y la disminución de la señal del pulso de glucosa 13C y que la RMN en células puede cuantificar la contribución de la unión de metabolitos a los flujos metabólicos en células vivas.

Se utilizó un modelo de unión competitiva de metabolitos marcados con concentración [A*] en presencia de metabolitos no marcados con concentración [A] para describir el efecto de la unión sobre la concentración de metabolitos libres marcados68. Este sistema se describe mediante dos ecuaciones de velocidad acopladas

y

donde [A*R] y [AR] son ​​las concentraciones de metabolitos unidos marcados y no marcados, respectivamente, k1 y k2 son constantes de velocidad de activación y desactivación, y [R] es la concentración de sitios de unión libres. Si las concentraciones totales de metabolitos marcados y no marcados y sitios de unión son [A]tot, [A*]tot y N, respectivamente, entonces [A*] = [A*]tot − [A*R], [A] = [A]tot – [AR] y [R] = N − [A*R] − [AR]. Es importante destacar que [A*]tot + [A]tot = [A]ss, donde [A]ss es la concentración de un metabolito en el estado estacionario isotópico. En general, (14) y (15) son ecuaciones diferenciales no lineales y solo pueden resolverse numéricamente. Sin embargo, si la concentración de metabolitos unidos es mucho menor que la concentración total de metabolitos, las ecuaciones. (14) y (15) son lineales y pueden resolverse exactamente68. La solución depende de las condiciones iniciales.

cuando [A*R] t = 0 = 0 y

cuando \(\left[ {{\text{A}}^{*} {\text{R}}} \right]_{{{\text{t }} = \, 0}} = {\text{ N k}}_{1}} {\text{A}}^{*}_{{{\text{tot}}}} /\left( {{\text{k}}_{{1} } \left[ {\text{A}} \right]_{{{\text{ss}}}} + {\text{ k}}_{2}} } \right)\).

Es importante destacar que el cambio en la concentración del metabolito unido a lo largo del tiempo se puede describir diferenciando (14) y (15) y presentando el resultado como

donde K = N k1 y α = k1 [A]ss + k2. Negativo d[A*R]/dt define f1(A*, t) en Eq. (7) y corresponde a las condiciones iniciales [A*R]t = 0 = 0 y d[A*R]/dt positivo define f2(A*, t) en la ecuación. (12) y corresponde a la condición inicial [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2).

Las ecuaciones (14) y (15) también son lineales cuando la concentración de metabolitos unidos es mucho menor que la concentración total de sitios de unión, N. En este caso, la solución también depende de las condiciones iniciales

cuando [A*R] t = 0 = 0 y

cuando [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). Es importante destacar que el cambio en la concentración del metabolito unido a lo largo del tiempo también se puede describir diferenciando (19) y (20) y presentando el resultado como

donde K = N k1, y α = k1 N + k2. En este caso, d[A*R]/dt negativo define f1(A*, t) y corresponde a las condiciones iniciales [A*R]t = 0 = 0 y d[A*R]/dt positivo define f2( A*, t) y corresponde a la condición inicial [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2). Soluciones numéricas para las Ecs. (14) y (15) en el caso general cuando [AR] o [A*R] son ​​comparables a [A]tot o [A*]tot se presenta en la Figura complementaria 5. Estas ecuaciones siempre se pueden ajustar usando un exponencial funcionan como la Ec. (18) con un factor R2 mejor que 0,99, lo que indica que una exponencial es una buena aproximación incluso en el caso general.

Se sembraron placas de seis pocillos con 3 × 105 células HEK 293T en 2 ml de medio Opti-MEM/5 % FBS y se incubaron en CO2 al 5 % durante 20 ha 37 °C. Se añadieron diez µl de LF en 200 µl de OptiMEM al primer pocillo y 5 µg de ARNm de luciferasa modificado más 10 µl de LF en 200 µl de OptiMEM a un segundo pocillo. Las transfecciones se incubaron en una cámara de crecimiento durante 5 h en CO2 al 5 % a 37 °C. El medio se reemplazó con 2 mL de OptiMEM/5% FBS precalentado y se permitió que las células se recuperaran durante 24 h en la cámara de crecimiento (28 h de descanso). El proceso se repitió para otros dos pocillos y la placa se incubó durante 4 h en la cámara de crecimiento (4 h de descanso). Antes del final de las 4 h de incubación, se añadió antimicina A, que inhibe el complejo de transporte de electrones, a otro pocillo a una concentración de 1,5 µM y se incubó durante 1 h. El pocillo se lavó una vez con OptiMEM tibio/FBS al 5 % y se repuso con 2 ml del mismo medio. Las células se recolectaron de los pocillos con tripsina-EDTA como se describe anteriormente y se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml, se lavaron dos veces con PBS modificado tibio, PBS que contenía MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM y glucosa 5,5 mM. Por último, todos los pocillos se tiñeron con MitoSOX 4 μM en PBS modificado durante 30 min en la cámara de crecimiento. Las células se centrifugaron a 300 g durante 5 min y se lavaron dos veces con PBS modificado y se volvieron a centrifugar. Las células se resuspendieron en 80 µL de PBS modificado y se dividieron en alícuotas de 10 µL en cada uno de los cuatro pocillos de una placa negra de 384w (# 784.086, Greiner Bio-One). La placa se leyó en un lector de placas Synergy H1 (BioTek) con excitación a 510 nm y emisión a 580 nm. Se diluyeron diez µl de cada suspensión celular en 245 µl de PBS y se contó manualmente el número de células usando un hemocitómetro.

Se recubrieron cubreobjetos de vidrio redondos de quince mm de diámetro (Ted Pella) con solución Cell-Tak (Corning) según las instrucciones del fabricante. Las células HEK 293T se cultivaron y trataron como los ensayos de placa ROS con las siguientes modificaciones. Después de transfectar las células, renovar el medio y dejar reposar durante 28 o 4 h, todos los pocillos se tiñeron añadiendo Mito Tracker Deep Red FM a una concentración final de 50 nM y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Los pocillos se lavaron con PBS y las células se recolectaron con 400 µL de tripsina/EDTA, se neutralizaron con 2 mL de OptiMEM/5%FBS, se centrifugaron, se lavaron dos veces con PBS modificado, se resuspendieron en tubos Eppendorf en el mismo tampón que contenía 4 µM. MitoSOX. Las células se incubaron a 37 °C durante 10 min, se lavaron y resuspendieron en 300 µl de PBS modificado y se añadieron a los cubreobjetos tratados con Cell-Tak para su fijación en la cámara de crecimiento durante 20 min. Uno de los pocillos, que contenía células HEK 293T no transfectadas, se trató con 1 µM de Antimicina-A. Después de la unión, todos los pocillos se lavaron dos veces con PBS. Se añadieron 300 µL de formaldehído al 4% y las células se fijaron durante 10 min a 37 °C. Las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 10 min con 1 μg/mL de colorante Hoechst 33,258 en PBS a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio usando Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences). Se tomaron imágenes de las células al día siguiente utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Zeiss LSM 710 (Microscopía Carl Zeiss) con un objetivo de 63 × y se analizaron con ImageJ (Instituto Nacional de Salud de EE. UU., https://imagej.nih.gov/ij/).

Para establecer la significación estadística entre los parámetros resueltos promedio, se realizó la prueba t no pareada usando Prism (GraphPad).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su archivo de información complementaria.

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El proyecto descrito recibió el apoyo de los números de concesión 1P01HL146367-01 y R01GM085006 del Instituto Nacional de Salud de EE. UU. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH.

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NS, DB, AMS, RR y AS escribieron el texto principal del manuscrito, SR, AL y TS prepararon las Figs. 1 y 6, AP preparó la Fig. 2, NS, JY y GT prepararon la Fig. 3, NS preparó las Figs. 4 y 5 y materiales complementarios, todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Alexander Shekhtman.

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Sciolino, N., Reverdatto, S., Premo, A. et al. El ARN mensajero en nanopartículas de lípidos rescata las células HEK 293 de la disfunción mitocondrial inducida por lípidos según lo estudiado por espectroscopía de RMN de persecución de pulso en tiempo real, RTPC-NMR. Informe científico 12, 22293 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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Recibido: 22 agosto 2022

Aceptado: 14 de diciembre de 2022

Publicado: 24 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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